十三章生物技术在植物育种中的应用市公开课获奖课件省名师优质课赛课一等奖课件.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考!,第十三章 生物技术在植物育种中应用,1/479,1、教学基本要求 （1）了解细胞工程与作物育种原理和基本方法；（2）了解作物转基因技术原理和基本方法；（3）了解分子标识主要类型和分子标识辅助选择育种原理和基本方法。,2/479,2、教学基本内容,第一节,细胞工程与作物育种,一、细胞和组织培养与作物育种 二、植物原生质体培养和体细胞杂交第二节 作物育种转基因技术 一、转基因技术发展现实状况 二、*转基因育种程序 三、转基因作物品种选育 四、转基因作物生物安全性第三节 分子标识辅助选择育种 一、*分子标识类型和特点 二、惯用分子标识原理和遗传特征 三、MAS育种方法,3/479,第十三章,生物技术在作物育种中应用,第一节 细胞工程与作物育种,4/479,植物细胞工程,（plant cell engineering）,是以植物组织和细胞培养技术为基础发展起来一门学科。它以细胞为基本单位，在体外（in vitro）条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞一些生物学特征按人们意愿生产某种物质过程。,5/479,细胞工程与作物遗传改良有着亲密关系，利用细胞工程技术已培育出一些大面积推广品种。,6/479,早期，哈布兰特在前人细胞学说影响下，提出,高等植物组织和器官能够不停分割,，并深入提出了,植物细胞全能性（,cell totipotency,）理论。,7/479,植物细胞全能性是植物细胞工程理论基础,。,细胞全能性是指细胞所含有形成各种细胞类型潜在能力，也包含植物细胞经脱分化再形成植株能力。,8/479,19，Hanning用萝卜胚培养，取得小植株，为组织培养工作奠定了基础。,9/479,1934,年，,White,对番茄切段进行培养，建立了第一个活跃生长无性繁殖系，取得了离体培养真正成功。三年后，,White,又发觉,B,族维生素对培养物生长有主要作用。,10/479,经过几年努力，以,White,为主几位科学家建立了植物组织培养（,plaint tissue culture,）综合培养基，成为以后各种培养基基础。,11/479,1948,年，,Skoog,等发觉腺嘌呤,/,生长素百分比是控制芽和根分化决定原因之一，这一发觉成为植物组织培养中控制器官形成激素模式。,Miller,（,1956,）发觉激动素比腺嘌呤更能促进芽形成。,12/479,1958,年，,Stewart&Shautz,从胡萝卜根,悬浮细胞,诱导分化成完整小植株，使,50,多年前哈布兰特提出细胞全能性假说首次得到科学验证，这一结果大大加速了植物组织培养研究发展。,1964,年，,Guha,等从曼佗罗,花药,培养出单倍体植株。,13/479,1970,年，,Kameya,等利用,花粉,培养取得单倍体植株。,1971,年，,Takebe,等首次从烟草,原生质体,取得再生植株；1972年，,Carlson,等取得第一个烟草,种间体细胞杂种,植株。,14/479,至此，在愈伤组织水平、单个细胞水平、单个生殖细胞水平、原生质体水平和体细胞杂种水平都取得了完整植株，充分证实了植物细胞全能性。植物组织培养流程示意图以下。,15/479,外植体起源外植体培养,愈伤组织 再生小植株再生植株,16/479,植物细胞工程应用在,20,世纪,60,年代就已受到重视，但真正应用研究在,70,年代才进入高潮。我国第一个用花药培养育成烟草品种，随即又育成了一些水稻、小麦新品种。,17/479,经济植物,快繁与脱毒,、体细胞变异筛选、新种质创造、细胞器移植、,DNA,导入等均对作物改良和农业生产起到了促进作用。,18/479,一、植物细胞和组织培养技术,19/479,（一）培养基及其组成,20/479,1、培养基（Medium）种类和特点,惯用培养基有,MS,、,B,5,、,White,、,N,6,、,KM-8p,、,SH,等。,21/479,2、培养基成份,培养基中都应包含植物生长必需,16,种营养元素和一些生理活性物质，通常将这些物质分为三大类，即无机营养物、有机物质和植物生长调整物质（表）。,22/479,表,植物组织培养所需养分和激素,水 ,有机物,大量元素,微量元素,PH,糖 N Fe Co ,氨基酸 P Zn Ni,维生素 K B Al,生长素 Ca Mn Mo,细胞分裂素 Mg Cu I,调整物质,赤霉素 S,脱落酸,乙烯,酵母提取物,椰子汁,成份不定物质,植物提取物,水解酪蛋白,蛋白胨,23/479,（二）培养基配制,24/479,1、母液配制,为了,降低配制培养基时每次称量药品麻烦，降低极微量药品在每次称重时误差,，普通先配制,高浓度贮备液，即,母液,。,25/479,大量元素可配成,10,倍母液,，使用时每配制,1000ml,培养基需要从母液中取,100ml,。配制母液时应做到分别称量，充分溶解，在混合次序上应最终加入,Ca,2+,，混合时要边加边,混合。,26/479,微量元素因为使用量低，普通配成,100,倍甚至,1000,倍母液,，使用时每配制,1L,培养基从母液中取,10ml,或,1ml,，配制时应注意充分溶解后再依次混合。,27/479,第三种母液即铁盐，,铁盐必须单独配制，,若与其它元素混合易造成沉淀。,普通采取鳌合铁,，即,FeSO,4,与,EDTA,钠盐混合物，普通扩大,200,倍。,28/479,EDTA,钠盐须用温水溶解，然后与,FeSO,4,液混合，在,7580,之间让其鳌合,1h,。,使用鳌合铁目标是防止沉淀，并使培养基能迟缓不停地供给,Fe,+,。,29/479,第四种母液为有机化合物母液，主要是维生素和氨基酸类物质，,这类物质不能配成混合母液，,一定要分别配成单独母液，,浓度为每毫升含,0.1,、,1,、,10mg,，使用时依据需要量取。,30/479,最终一个母液是激素，,每种激素应单独配制母液,，其浓度为,0.1,、,0.5,或,1.0mg/ml,。各种激素难溶于水，配制时应注意溶解次序。,31/479,IAA,、N,AA,、,GA,3,、玉米素先溶于少许,95%,酒精，再加水定容；,NAA,可溶于热水或少许酒精后，再加水定容；,2,，,4-D,不溶于水，可用,1mol,NaOH,溶解后再定容；,KT,和,BA,应先溶于少许,1mol HCl,中，然后定容。,32/479,表,一些植物组织培养基成份（,mg/L,）-,成份,MS,B5 OR White Nitsch SH,Heller LS,ER-,大量元素,NH,4,NO,3,1650 -1650 -720 -1650 1200KNO,3,1900 2527.5 1900 80 950 2500 -1900 1900CaCl,2,2H,2,O 440 150 -200 75 440 440CaCl,2,-440 -166 -MgSO,4,7H,2,O 370 246.5 370 750 185 400 250 370 370KH,2,PO,4,170 -170 -68 -170 340NH,4,H,2,PO,4,-340 -,（,NH,4,）,2,SO,4,-134 -Ca,（,NO,3,）,2,4H,2,O -300 -NaNO,3,-600 -NaH,2,PO,4,H,2,O -150 -19 -125 -KCl -65 -750 -,33/479,-,成份,MS,B5 OR White Nitsch SH,Heller LS,ER-,微量元素,KI 0.83 0.75 3.32 0.75 -1 0.01 0.83 -H,3,BO,3,6.2 3 24.8 1.5 10 5 1 6.2 0.63MnSO,4,4H,2,O 22.3 -89.2 5 25 -0.1 22.3 2.23MnSO,4,H,2,O -10 -10 -Zn SO,4,7H,2,O 8.6 2 34.4 3 10 1 1 8.6 -Zn SO,4,4H,2,O -Zn Na,2,EDTA -15Na,2,MoO,4,2H,2,O 0.25 0.25 1.0 -0.25 0.1 -0.25 0.025MoO,3,-0.001 -Cu SO,4,-0.2 -Cu SO,4,5H,2,O 0.025 0.025 0.1 0.01 0.025 -0.03 0.025 0.0025CoCl,2,6H,2,O 0.025 0.025 0.1 -0.1 -0.025 0.0025CoSO,4,7H,2,O -0.03 -AlCl,3,-NiCl,2,6H,2,O -0.03 -,-,34/479,-,铁盐成份,MS,B5 OR White Nitsch SH,Heller LS,ER -FeCl,3,6,H,2,O -1 -Fe,2,(SO,4,),3,-2.5 -FeSO,4,7,H,2,O 27.8 -27.8 -27.8 15 -27.8 27.8Na,2,EDTA2H,2,O,37.3 -37.3 -37.3 20 -37.3 37.3NaFe,EDTA -28 -1 -,35/479,成份,MS,B5 OR White Nitsch SH,Heller LS,ER,有机物,盐酸吡哆醇,0.5 1 1 0.01 0.5 0.5 -0.5,盐酸硫胺素,0.1 10 13 0.01 0.5 5 -0.4 0.5,烟酸,0.5 1 1 0.05 5 5 -0.5,肌醇,100 100 100 -100 1000 -100 -,甘氨酸,2 -3 2 -2,脯氨酸,-1381 -,叶酸,-0.5 -,生物素,-0.05 -,蔗糖,3%2%3%2%2%3%-3%4%,36/479,2、培养基配制,以配制,1L,培养基为例，培养基配制方法以下：,37/479,混合各成份母液。取大量元素母液,100ml,、微量元素母液,10ml,、铁盐母液,5ml,于一个,1L,烧杯中，依次加入有机成份和激素，并加水至,500ml,。,38/479,熔化琼脂：称,78g,琼脂和所需蔗糖于另一,1L,烧杯中，加水至,500ml,，待糖溶解后，加热使琼脂充分熔化。,39/479,将（,1,）和（,2,）混合，搅拌均匀，补水至,1000ml,。,40/479,调,PH,。普通用,0.1mol NaOH,或,1N HCl,调,PH,至所需,PH,。普通,PH,调至,5.8,，但也有,PH,调到,7.0,，不一样材料最适,PH,不一样。对培养基凝固来说，,PH,较高时，培养基过硬，不便于培养材料吸收营养；,PH,过低，低到,4.0,以下时，培养基极难凝固。,41/479,分装：将培养基分装于,100ml,或,50ml,三角瓶中，每瓶,50,或,30ml,左右，封口包装。,42/479,灭菌：普通用,1.1kg/cm,2,压力，在,121,下灭菌,1520min,。灭菌时间应依据材料掌握。时间短，灭菌不彻底；,时间长，会引发培养基成份降解。,43/479,放置备用。灭菌后取出培养瓶放置在培养台上，使之冷却凝固。培养瓶应平放，以免形成斜面。,44/479,（三）无菌操作方法,45/479,1、消毒剂,在接种前，必须使材料完全无菌，这是取得植物组织培养成功基本确保。要确保这一点，取材时应选取植物组织内部无菌材料。从健壮植株上取材，不要有伤口；严格预防病虫。,46/479,应在晴天取材，最好中午或下午取材。最好防止选取田间材料，选取无菌苗很好。非要用田间材料时，为防止消毒困难，可将材料种在大棚或生长箱里。惯用消毒剂见表。,47/479,表,植物材料消毒惯用消毒剂及使用方法,-,消毒剂,使用浓度 消除难易,消毒时间 消毒效果 （,%,）,（,min,）,-,次氯酸钠,2,易,530,很好,次氯酸钙,910,易,530,很好,漂白粉,饱和溶液,易,530,很好,氯化汞,0.11.0,较难,210,最好,酒精,7075,易,0.22,好,H,2,O,2,1012,最易,515,好,溴水,12,易,210,很好,AgNO,3,1,较难,530,好,抗生素,450mg/L,中,3060,很好,48/479,对于难消毒材料，如有茸毛、粗糙不平材料等，在消毒前，普通先用肥皂水洗，自来水冲净，在,70%,酒精或,1L HCl,中浸,30s,，再加入消毒剂。不一样材料消毒方式和所需时间不一样，研究者应依据不一样材料确定详细消毒方案。,49/479,2、无菌操作,准备好接种材料用培养基、待消毒材料、无菌水、无菌烧杯及其它必需玻璃器皿、无菌操作工具（如剪刀、镊子、解剖刀等，这些工具可用高温消毒，也可用高压高温灭菌，也可随用随消毒）、,70%,酒精等。,50/479,将超净工作台打开，让其运行,10min,左右，在超净工作台上打开烧杯和无菌水瓶盖，将,HgCl,2,（,0.1%,）倒入有待消毒材料烧杯中，,510min,后取出另一盛有没有菌水烧杯中，无菌水冲洗,34,次，然后将材料取出接种在培养基中，封口，放入培养室培养。,51/479,无菌操作时应注意下面几个问题：整过操作过程一切用具必须一直保持无菌状态；无菌操作前必须用肥皂洗手，然后用,70%,酒精洗手；操作时无菌器皿一旦打开，应尽可能防止手再从其上横过；防止强呼吸，呼吸时应将脸移开超净台；每次重新操作都要把工具在火焰上消毒，防止交叉污染。,52/479,3、无菌培养,材料接种后移入培养室培养，普通培养室要求非常卫生，恒温，有理想光照控制系统，普通材料要求,25,左右，晚上普通不低于,20,。,53/479,二、,细胞和组织培养与作物育种,54/479,（一）,体细胞克隆变异及其育种利用,55/479,在近,50,年中，以植物组织培养为基础生物技术研究与发展为植物育种提供了一些新试验方法和伎俩，而且培养出一些在生产上有利用价值品种。,56/479,体细胞克隆变异指植物组织和体细胞培养物在培养过程中产生变异,。,Larkin,等（,1981,）在其综述文章中开始使用“体细胞克隆变异”（,somaclonal variation,）这一概念。,57/479,为了区分起源于体细胞和单倍体细胞变异，Evans未来自配子体组织变异称为“配子体克隆变异”（gametoclonal variation），以与体细胞克隆变异区分开。,58/479,对于遗传变异分析而言，,Orton,为了统一术语，引进了,R,0,、,R,1,、,R,2,等，分别表示,再生,当代、自交第一代、第二代等，至今这一概念还在广泛应用。,59/479,1、体细胞克隆变异遗传基础,（,1）染色体数目变异,最多见是多倍体，主要是培养基中使用了细胞分裂素。,60/479,变异大小与培养状态、年纪、原始材料倍性及培养时期相关。研究发觉：二倍体变异频率随培养时间延长而降低，四倍体变异频率却随培养时间延长而增加。,61/479,（,2）染色体结构变异,染色体结构变异似乎是体细胞克隆变异主要起源，最主要是染色体缺失、倒位、重复和异位。很多体细胞再生株减数分裂时形成多价体、染色体桥、小片段、环等，充分说明了染色体结构变异存在。,62/479,（,3）点突变,这类突变可分为各种类型，一个类型是,自发突变,，最早证实点突变存在是从烟草中利用体外筛选取得抗,chlorsulfuron,突变体。很多经过细胞筛选取得抗病、抗除草剂等突变体属于这类。,63/479,另一个点突变是诱发突变，培养基中加入化学诱变剂或进行诱变处理。因为培养过程中，培养物一直处于诱变环境条件下，所以突变终究是,自发,还是,诱发,极难搞清楚。,64/479,第三种点突变是,基因表示及基因放大或衰减。,高等植物一些基因在发育过程中受到某一环境刺激，能够,放大自己，即基因拷贝数大量增加,，这意味着该基因转录,mRNA,及蛋白质增加。最初在动物细胞培养中发觉这一现象，以后在植物中发觉也存在。,65/479,比如，对某一物质抗性，能够经过逐步增加浓度方法而使细胞对该物质抗性提升很多倍，这就是基因放大系统存在很好例证。一样，也发觉植物细胞,DNA,丢失（衰减），,如大豆悬浮系经过较长时间培养，其核糖体基因丢失了,1/3,。,66/479,第四种点突变是有丝分裂交换。这种交换尽管很微弱地改变了基因次序，但仍影响基因表示。这种改变包含：某一基因拷贝丢失，某一基因拷贝重复或修复过程中基因转变。,67/479,转座因子也是造成体细胞突变原因之一，转座子经过插入与解离使一些基因表示受到调控。,68/479,最终细胞质基因叶绿体和线粒体基因也能发生突变。,Gengenbach et al,（,1975,）利用玉米,T,小种毒素筛选取得了抗,T,小种细胞系，这个基因已知位于胞质中。,69/479,离体培养细胞会产生各种类型突变体，除抗性突变体外，还有形态性状突变体、不育性、产量和品质性状改变等。形态变异如矮化性、叶型等，利用这些变异能够进行高光效育种。,70/479,培养再生植株中出现不育性频率较高，但大多为核基因突变，能够用来培育不育系。产量和品质突变必须在田间经过适当分析才能确定。试验室内细胞水平突变体筛选多数在抗性突变体方面开展工作，如抗病、耐盐、抗重金属等。,71/479,2、突变体筛选,为了增加突变频率，需要进行诱变处理。将外植体、愈伤或悬浮系用诱变剂处理，如使用化学诱变剂，要充分洗涤后再进入下一步工作。使用多大剂量和处理多长时间才能到达很好诱变效果，应依据详细试验确定。,72/479,在突变体筛选中常采取两种选择法，即一步筛选法和多步筛选法。一步筛选法是,将培养物接种在含有最低全部致死剂量培养基上,，表现出生长培养物再转移到含有抑制剂新鲜培养基上。,73/479,能够看出，这种方法是一次就把,筛选压设定很高,，使不抗细胞（野生细胞）完全不可能生长，筛选出能生长细胞即为耐（抗）性细胞系。,74/479,但在有些情况下这种方法不一定实用，有细胞在超出最低全部致死浓度时，细胞均死亡，或单个细胞不能生存。多步筛选法是首先使用半致死剂量对细胞进行筛选，每次继代将上代能生长细胞系继代到筛选剂浓度提升新鲜培养基上。,75/479,在这种筛选体制下，抗性细胞应该比野生细胞长快，经过逐步增加筛选剂水平，最终会筛选出在抑制剂超出最低全部致死浓度时也能旺盛生长细胞系。,76/479,不过，去除抑制剂后，抗性培养物稳定性是常出现一个问题，抗性丢失来自很多原因，包含细胞对抑制剂生理适应。可见，多步筛选易取得在某一抑制剂水平下，细胞稳定生长细胞系。,77/479,筛选材料对象能够是原生质体、愈伤块、悬浮培养物和花粉,/,小孢子培养物。利用原生质体进行抗性筛选有一大优点：筛选出克隆极有可能来自单细胞，不过操作困难。,78/479,利用愈伤块筛选是最简单方法，但这种筛选存在一定缺点，愈伤块里各个细胞不能均等地接触抑制剂，下部愈伤细胞比上部细胞吸收到较多抑制剂，这么就使筛选结果在一定程度上失去可靠性。,79/479,悬浮细胞筛选也很惯用，细胞接触选择剂较均匀，但存在一定操作复杂性。花粉,/,小孢子培养物用于突变体筛选有一定优势，突变体很轻易表现出来，也很易纯合。,80/479,3、在作物改良上应用,利用上述方法便可筛选体细胞克隆变异，将这一技术应用于作物改良技术路线见图。,81/479,优良品种,细胞培养,R0,R1,群体,改良体细胞克隆,确定遗传方式,田间试验,遗传稳定性测试,多点田间试验,育成新品系,继续田间试验，种子富集,区域试验,审,定,投入生产,图,利用体细胞克隆变异育种技术路线,82/479,（二）,单倍体细胞培养及育种利用,83/479,1、单倍体细胞培养在遗传和育种中应用价值,花药培养（,anther culture,）是指在取得单倍体一个技术，之后，花粉和小孢子培养逐步取得成功，从而使单倍体细胞培养体系愈加完善。单倍体在遗传和育种研究中有以下优点：,84/479,（,1）后代快速纯合,经过单倍体快速产生纯系。在异花授粉作物中，可用单倍体产生加倍单倍体（,DH,系），从中筛选纯合自交系用于杂交制种。因为加速纯合，从而就缩短了育种周期（图）。,85/479,母本,父本,F,1,花药培养,F,2,花粉植株,加倍,品系比较试验,选择判定,区域试验,图 杂交育种与单倍体育种周期比较,86/479,（,2）提升选择效率,假如某一性状受一对基因控制，在,AA,aa F,2,中，纯合,AA,个体只有,1/4,。如,F,1,采取花药或花粉培养，产生后代中,AA,个体占,1/2,，比常规杂交育种提升一倍。,87/479,（,3）排除杂种优势对后代选择干扰,对于杂交育种来讲，因为低世代很多基因位点尚处于杂合状态，会有不一样程度杂种优势表现，对个体选择会造成一定误差。采取,DH,群体进行选择育种，因为各基因位点在理论上均处于纯合状态，选择到变异能更大程度上代表真实变异。,88/479,（4）遗传研究良好材料体系,单倍体是基因互作检测、遗传变异估,计、连锁群构建、,QTL,预计及定位等数量遗传学良好材料。尤其是近代分子生物学发展，,DH,系成为分子标识作图良好群体，它在一定程度上成为一个永久,BC,或,F,2,群体。,89/479,（5）,突变体筛选,因为单倍体各基因均处于纯合状态，突变体很轻易表现出来，从而大大提升了抗性或其它突变体筛选效率，利用这一体系取得各种突变体事例已很多，这里就不一一赘述。,90/479,2、离体培养条件下小孢子发育,小孢子母细胞经减数分裂形成四分体小孢子，然后经单核早期、单核靠边期、双核期（一个营养核和一个生殖核），最终抵达三核期而成为成熟花粉粒。在离体培养条件下，花粉正常发育路径受到抑制。,91/479,3、影响花药培养原因,（,1）供体植株生长条件,供体植株生长条件对培养效果有主要影响，有时只有在控温、一定光周期和光强条件下，其花药才能有反应。环境条件对于不一样植物种有很大不一样，所以没有一个固定环境控制模式。,92/479,（2,）,供体植株年纪,供体植株对培养效果也有一定影响，普通讲，开花早期植株花蕾易于培养。,93/479,（,3）花粉发育时期,用于培养花蕾，其花药内小孢子发育时期对培养效果有较大影响，但因物种而异。在烟草中，处于第一次有丝分裂期花粉效果最好，而在禾本科和芸苔属中，单核早期最好。,94/479,（4）,花蕾和花药预处理,对于有些物种，培养前对花药和花蕾进行预处理，能显著提升培养效果。如大麦花药，,4,处理,28d,，或,7,处理,14d,，能收到最好效果。可对整穗、小穗、甚至分离花药施加预处理，只要注意处理期间不要与水接触。也有些人将花药接种后放在低温下预处理，不一样材料需不一样预处理方式，没有一个固定模式。,95/479,（,5）培养基,终究使用固体或液体培养基应依据培养材料要求定。多数情况下，MS、N,6,及马铃薯提取液培养基在禾谷类作物中用较多。花药培养时往往需要一定渗透压，有要求低浓度蔗糖（2%,4%），有要求高浓度蔗糖（8%,12%,）。,96/479,二细胞结构成熟花粉往往需低浓度糖，而三细胞结构成熟花粉植物往往需高渗条件，如油菜小孢子培养时，糖浓度可用到,13%17%,。培养基中所添加维生素和激素对培养效果可产生主要影响。对于一些植物种来讲，添加某种植物提取物或椰汁能够改进培养效果。,97/479,（6）培养条件,多数植物在,25,下培养能诱导愈伤组织，可一些植物，尤其是芸苔属，在高温,35,下处理几天，然后进入,25,培养能收到最好效果。花药培养普通在暗处进行，直到愈伤或胚状体形成再转到光下培养。另外，接种花药外植体置向、培养密度等有时对培养效果也有影响。,98/479,4、花粉（小孢子）培养,花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养技术。其优点在于花粉已是单倍体细胞，诱发后经愈伤组织或胚状体发育成小植株都是单倍体植株或双单倍体，不含药壁、花丝、药隔等体细胞组织干扰而形成体细胞植株，但它培养难度大。,99/479,5、单倍体诱导中存在问题,对于多数植物来讲，能形成有活力胚花药百分率很低，除此之外，还有很多问题存在。,100/479,通常花药或花粉离体培养时没有生长和发育迹象，或刚开始生长便造成胚败育；在产生单倍体同时产生二倍体或四倍体；培养中我们需要小孢子分裂，而二倍体组织不分裂，但这种情况往往难以办到；白化苗难以防止，尤其是在禾本科作物中；在混倍性材料中极难分离出单倍体，因为单倍体细胞生长很易被生长旺盛多倍体细胞所掩盖。,101/479,6、单倍体细胞培养与植物育种,单倍体是高度不育，需要进行加倍处理才能应用。秋水仙素是惯用染色体加倍药剂，能够用,1%,秋水仙素对正处于对数生长久悬浮细胞进行处理，普通,24h,左右。也可在固体培养基中加适当浓度秋水仙素。,102/479,花粉植株在培养过程中能够自然加倍，但频率很低。将单倍体植株组织或器官用作外植体，重新诱导愈伤组织，让培养细胞在培养过程中自然加倍也是一个方法。,103/479,A,品种,B,品种,F,1,杂交种,小孢子培养或花药培养,单倍体培养,染色体加倍,重组纯合系,选择,重组了A和B品种优点纯系,自交、田间测试,遗传稳定性测试,田间测试,新品系确定遗传基础,品种 亲本,-,杂交,推广利用 杂种优势利用,图 单倍体细胞培养及育种技术,104/479,（三）幼胚培养与远缘杂交育种,105/479,植物胚胎培养（embryo culture）是指使胚及具胚器官（如子房、胚珠）在离体无菌培养条件下发育成幼苗技术。植物幼胚和胚珠培养是植物远缘杂交育种主要辅助伎俩。,106/479,（四）种质长久保留,107/479,细胞培养和茎尖培养再生植株技术实现为离体试管保留种质提供了条件，这种方法只需要较少空间就能保留大量无性系，而且保留过程中可防止病虫害侵袭，在特定条件下能够长久保留，需要时候只需将材料取出来快速繁殖即可。,108/479,保留材料能够是各种类型，依植物材料性质和需要定。材料能够是愈伤组织、茎尖、幼胚、花粉形成单倍体愈伤组织等。,109/479,保留方法主要有迟缓生长保留法和超低温保留法。对于生长迟缓材料，在常规培养条件下就能保留很长时间，但大多数植物离体培养时需要频繁继代，需要经过降低生长速度来延长继代间隔。,110/479,迟缓生长法主要是基于改变培养环境和修改培养基来实现对种质资源进行短期和中期保留。迟缓生长法保留技术包含降低培养温度、降低氧气含量、将组培材料脱水干燥等。,111/479,超低温保留法能够长久保留植物材料，不需要继代，其原理是在超低温情况下，使生物代谢和衰老过程大大减慢甚至完全停顿。,112/479,超低温通常指低于-80低温，保留介质或容器有干冰（-79）、超低温冰箱（-80150）、液氮（-196）和液氮蒸汽相（-140）等，其中液氮最惯用。,113/479,超低温保留与迟缓生长保留法相比，含有一定技术复杂性，使用时应依据详细材料和相关文件确定技术方案。,114/479,（五）脱毒及繁殖主要品种或材料,115/479,多数作物，尤其是无性繁殖作物，因为病毒或其它病原菌侵袭，有一个产量和品质下降过程，经常需要对受病毒侵染材料进行脱毒处理。病毒在植物体内分布是不均匀，在受侵染植株中，顶端分生组织普通不带毒，或只携带浓度很低病毒。,116/479,因为存在这一规律，我们便可利用茎尖培养方法使植物脱去病毒。植物茎尖脱毒在无性繁殖作物提纯复壮中有很主要应用价值，如马铃薯、甘薯、果树、多年生花卉等。,117/479,组织培养在植物快速繁殖中有很好用途。大多数果树和观赏植物是高度杂合，它们种子后代无法与原品种相同，在这种情况下，如要保持原种特征，需利用茎尖培养快速繁殖。另外，茎尖培养在保留稀有野生资源、繁殖不育远缘杂种等方面含有优势。,118/479,植物材料快速繁殖主要是经过诱导茎芽形成实现，能够经过两种路径使茎芽增殖。一个是经过愈伤组织诱导丛生芽形成，然后分株培养，便可取得大量遗传上基本一致无性系。,119/479,另一个是诱导茎尖或不定芽萌发或形成丛生芽也可到达快速繁殖目标。一些腋芽、植物器官或节段起源芽，普通处于休眠状态，经过离体培养可解除休眠而萌发。植物脱毒与快速繁殖技术很易使一些作物，如甘薯、果树、经济林木等形成产业化，创造显著经济价值。,120/479,（六）人工种子生产,121/479,人工种子（artificial seeds）是指将细胞培养所产生体细胞胚或其类似物，经过有机化合物包埋而形成能在适宜条件发芽类似于天然植物种子颗粒体。,它通常由三部分组成：体细胞胚、人工胚乳、人工种皮。,122/479,人工种子研究在农业生产上有主要意义，它在固定杂种优势、快速繁殖良种和不育材料、节约用种、工厂化生产种子方面都有潜在价值。对木本植物来说，用人工种子可无须等候漫长有性世代，即能够快速繁殖优良性状转基因植物推广到生产上去。另外，人工种子体积小，便于运输。,123/479,三、植物原生质体培养和体细胞杂交,124/479,植物原生质体（protoplast）是一个没有壁细胞，因为没有壁及质膜暴露在外界环境下，使原生质体结构变得很脆弱，在没有一定渗透剂和稳定剂情况下，很快会破裂。因为上述特点，使得原生质体操作难度较大，可一旦再生了壁就恢复了细胞全能性，含有了同正常细胞一样特征。,125/479,（一）原生质体分离,126/479,原生质体分离最基本标准是确保原生质体不受伤害及不损害它再生能力，其先决条件是要有一个适当渗透压。,127/479,1、分离方法,分离原生质体方法普通有机械分离和酶法分离两种。,128/479,机械法分离是早期采取分离方法，先对材料进行质壁分离处理，然后切割，这一过程中会释放出少许不受损伤原生质体。用这一方法,仅能从液泡很大材料中取得原生质体,，而不能应用于分生细胞。,129/479,酶法分离原生质体是当前惯用方法，可分为一步法和二步法。一步法是将果胶酶（pectinase）和纤维素酶（celluluse）等混合处理材料，直接分离取得原生质体。,130/479,二步法是先用果胶酶处理材料，降解细胞间层使细胞分离，再用纤维素酶水解胞壁释放原生质体。当前多用一步法。,131/479,2、影响原生质体分离原因,（,1）材料起源,叶肉细胞是惯用材料,，因为叶片很轻易取得而且能充分供给，其次为愈伤细胞或细胞悬浮培养物。从叶片起源原生质体在遗传上较一致，而培养细胞起源原生质体则不然，因为培养细胞在培养过程中易产生变异。,132/479,但由愈伤或悬浮系起源原生质体，能够防止植株生长环境不良影响，还能够常年供给，易于控制新生细胞年纪，处理时操作简便，无需消毒。另外，从根、茎、叶、花、果实、胚芽鞘、子叶、花粉、四分体等均能分离原生质体。,133/479,（2）渗透压,原生质体分离之前必须确定一个适合渗透压。在这种渗透压下，原生质体分离、纯化过程中都不致使原生质体受损伤。,134/479,（3）酶,植物细胞壁是一个复杂结构，由纤维素和半纤维素组成，需要一定酶组成才能降解它。广泛使用商品酶制剂能够从很多企业购置。,135/479,（4）分离培养基,Ca,2+,对原生质体产量和稳定性有很大影响，它是细胞壁主要成份，同时能稳定膜结构。另外，Mg,2+,、PO,4,3-,对于原生质体活力保持也有主要作用，所以分离原生质体培养基中除酶外，普通含这些离子。,136/479,（5）培养条件,酶处理时温度和pH最主要。PH使用范围为4.8-7.2，可是，高pH（大于6.0）普通有利于原生质体生存，可能是高pH降低了细胞壁降解时产生有害酶活性和存在于分离培养基中毒性物质活性。为了预防pH改变，常加入MES2（N-morpholino）-ethanesulfonic acid。这是一个缓冲剂，普通使用量为3mM。,137/479,分离原生质体培养时间与温度成反比，可是，高温下短时间分离原生质体不适于培养，它们易发褐和破裂。惯用温度为23-32。有材料温度很低，5-10。也有高、低温结合使用。酶处理时普通在暗处培养，但有些材料在光下有利。培养过程中，间断低速震荡有利于酶渗透。,138/479,（6）组织前处理,高渗前处理、激素处理、低温处理、激素与低温结合前处理等对不一样植物原生质体分离可能有很好效果。,139/479,3、原生质体搜集、纯化和活力测定,原生质体酶解完成后，将其用200目筛过滤，滤液再用400目过滤，搜集滤液，低速离心，去上清液。用含有酶解液一样渗透剂无酶CPW液将原生质体悬起，再离心，去上清，重复几次，便完成原生质体洗涤工作。,140/479,原生质体纯化可采取蔗糖悬浮法、梯度离心法或二相界面法，详细操作方法可参考专业书籍。用Evans blue或FDA测定原生质体活力，以确定原生质体分离效果。,141/479,（二）原生质体培养,142/479,原生质体培养前必须调到一定密度，普通,10,3,-10,5,/ml,密度比较适合原生质体培养。原生质体培养方法各种各样，依作物和材料起源而异。平板培养、液体浅层培养、悬浮培养、液-固双层培养、琼脂糖包埋、看护培养等是原生质体培养惯用方法。,143/479,但不论哪种培养方法，在培养过程中，都应依据细胞生长情况不停降低渗透压。待肉眼可见细胞团形成后，便可转移到普通细胞培养基上进行细胞繁殖和分化工作。,144/479,影响原生质体培养原因很多，物理条件如密度、光照和温度等都会影响培养效果。低于一定密度原生质体不能分裂，普通认为大群体原生质体有利于将培养基中原生质体在培养过程中释放有害物质脱毒。,145/479,原生质体培养普通在暗处进行，有利于壁形成和细胞再生，有物种一直在暗处直到形成愈伤组织，有一周后移到光下。,146/479,原生质体培养普通在22-25进行，高、低温都有害。但有植物要求27-30，在25时不能形成愈伤组织。,147/479,原生质体比细胞需要更复杂培养条件，有时需要在有喂养层细胞情况下原生质体才能再生。培养基无机营养和有机营养组成都对培养效果有显著影响。,148/479,选择适当渗透压对于取得大量原生质体并保持其活力均很主要，普通用甘露醇或山梨醇调整渗透压。在培养过程中普通需降低渗透压以促进分裂。,149/479,对于琼脂糖包埋培养，可将其切成小块，转移到低渗液体培养基中漂浮培养，液体培养则可加入低渗一定体积培养基，但普通每一步降低程度不超出25%。现在一个趋势是将蔗糖或葡萄糖单独使用或与甘露醇结合作为稳定剂，一旦糖被降解，培养基渗透压降低，利于细胞分裂。,150/479,生长素对于培养早期壁形成是需要，最惯用是2，4-D，有时需要生长素与分裂素结合使用。生长素使用量一定要小心确定，因为它很轻易使液泡长大或增加新液泡而使细胞分裂。,151/479,试验证实，生长素经过调整一些特异mRNA合成而起作用。分裂诱导后，需要转到低生长素条件下才能促进细胞生长。另外，维生素、水解酪蛋白、椰汁等，对原生质体生长有促进作用。在培养过程中也需注意一些氨基酸使用。,152/479,原生质体形成愈伤团后，便可采取常规愈伤组织培养方法使细胞扩大繁殖或分化形成植株。,153/479,（三）细胞融合（体细胞杂交）,物种间生殖隔离妨碍了物种间基因交流，从而给作物育种带来很大不足。原生质体融合技术是实现基因重组一条路径，当前利用细胞融合已从很多作物种、属间，甚至科间取得杂种体细胞杂种，创造了一些自然界不存在植物类型，有效地拓宽了植物育种资源。,154/479,1、融合方法,分离原生质体不带电荷，它们相互排斥，所以普通要在诱发条件下才能发生融合。异种原生质体首先发生膜接触，然后两个原生质体形成细胞质桥，最终两种细胞质将两个核包围起来而完成融合。惯用融合方法简单介绍以下：,155/479,（1）NaNO,3,处理诱发融合,由NaNO,3,诱导可重复、控制离体原生质体融合是由Power等（1970）报道。利用这一融合剂，Carlson等（1972）即使在植物中取得了第一个