染色质免疫共沉淀技术(ChIP).doc

◇ 2006年 第4期 (总第8期)

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功能基因组学研究方法及其进展
功能基因组学（Functional genomics）是利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。它的研究内容是人类基因组DNA序列变异性研究、基因组表达调控的研究、陌生生物体的研究和生物信息学的研究等。
目前功能基因组学的研究策略包括以下4个方面：1）建立表达图谱：建立表达序列标签、扣除文库、DNA 芯片、蛋白质组等。2） 随机突变筛选：在基因组中进行随机诱变和筛选，如ENU、iRNA、T-DNA、EP-转录子等等。3） 定向诱变：进行有目的的基因诱变，如基因敲除。4）生物信息学研究：分析基因蛋白质结构和功能比较的信息。经典的技术在大量未知基因的研究中具有局限性，
目前，一些新技术包括生物芯片、基因敲除(knock out)、 转基因（knock in）、RNA干扰（RNAi）以及蛋白质组学研究中的各种技术，在功能基因组学研究中发挥越来越重要的作用。建立、应用、发展并完善这些新的技术非常必要，近几年这些技术有了新的发展，本文就近几年来功能基因组学方法的一些进展作简单介绍。
1 染色质免疫共沉淀技术（ChIP）及与芯片方法的结合
1. 1染色质免疫共沉淀技术
染色质免疫沉淀技术（ChIP）是一种在体内研究DNA与蛋白质相互作用的方法。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来，这种技术得到不断的发展和完善。ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP -chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；ChIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。它与DNA芯片和分子克隆技术相结合，可用于高通量的筛选已知蛋白质分析的未知DNA靶点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况。
染色质免疫共沉淀-芯片(Chromatin Immunoprecipitation -chip简称 ChIP-chip )，它的基本原理是在生理状态下把细胞内的蛋白质和DNA交联在一起，超声波将其打碎为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过所要研究的目的蛋白质特异性抗体沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息[1-2]。
1.2 染色质免疫共沉淀-芯片技术(ChIP-chip)的应用
ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著，同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。目前ChIP-chip技术研究主要集中于两个领域：及转录因子的结合和条件特异性；组蛋白的修饰，组蛋白修饰蛋白和染色体重建。

1.2.1 ChIP-chip 在描述转录结合因子动力学中的研究
早Yong研究团体等人采用ChIP-chip的方法鉴定了酵母菌中转录调控子Ste12p, Gal4p的DNA结合位点和调控途径[3]，Brown等人发展了斑点DNA芯片技术，人们对酵母菌中的转录因子SBF和MBF进行了与上述试验相类似的研究[4-6]。此后，人们采用此方法对酵母菌转录因子进行了大量的研究[7-9]；其中最引人注意的是Young研究团体等人采用ChIPs法和微阵列法对酵母菌的106个抗原决定基已知的转录因子的结合位点做了鉴定，并且利用得到的数据结合mRNA 表达芯片的数据用以说明酵母菌的代谢调控网络；B. Ren等人采用ChIP法对酵母菌基因组的基因间区域和已知启动子进行了研究[10]。
1.2.2ChIP-chip 在组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用
研究人员得出了对与组蛋白的酶的修饰有关的染色体范围的蛋白质分布和后转录修饰对了解染色质动力学的重要性[11]。Ng HH等人发现组蛋白H3 的4赖氨酸转甲基酶Set1p表现出优先停留在Pol II转录的基因座上[12]。Kurdistani SK研究分析了Rpd3p的结合位点，检验了Rpd3p的结合和它与蛋白质Ume1p 和Ume6p的关联[13]。Moqtaderi Z等人采用ChIP-chip方法阐述了酵母菌中RNA聚合酶Ⅲ的固有转录调控规则[14]。
此外，该方法还用来研究染色体结构组分的分布。Smith 等人证明端粒蛋白p1p Rif1p 和Rif2p和端粒酶组分Est2p与端粒之间具有有细胞循环依赖模式[15]。这种模式似乎可以调节端粒的长度。此外，有人用ChIP-chip 方法研究了黏连蛋白在基因组中的广泛分布[16]。同时，姐妹染色单体黏连蛋白的多亚基复合物也得到了描绘[17]。
ChIP-chip 技术的优点是，可以在体内进行反应；在给定的检验细胞环境的模式下得到DNA相互关系的简单影像；使用特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的蛋白质的相关位点；直接或者间接（通过蛋白质与蛋白质的相互作用）的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是：需要一个特异性蛋白质抗体，有时难于获得；为了获得高丰度的结合片段，必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况；调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中[2]。
总之，ChIP-chip 技术的发展为析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中，将对芯片的构建进行改进，提高其实用性。使用易于获得抗体，增加这种方法的可用性。
2比较基因组杂交芯片
2.1 比较基因组杂交芯片技术

图 2 array-CGH流程图
Fig 2 Procedure of array-CGH .

比较基因组杂交芯片或者基于芯片的比较基因组杂交（Comparative Genomic Hybridization Array或者Microarray-based comparative genomic hybridization）阵列-比较基因组杂交技术（array comparative genomic hybridization, array CGH）能在全基因组水平或高分辨率基础上检测染色体拷贝数的变化。比较基因组杂交（CGH）是在荧光原位杂交基础上加以改进而形成的一项分析细胞遗传学技术，它不需要对待测细胞进行培养，也不必制备特异区域探针，一次试验即可检测全部待测基因组DNA拷贝数改变。为了克服CGH技术的不足，研究人员建立在芯片基础上新的CGH技术。Array-based CGH 技术的原理就是用微阵列形式代替通常使用的正常中期染色体,通过用不同颜色荧光素分别标记肿瘤及正常对照DNA，并同时与制备好的芯片杂交, 通过观察红绿荧光的强度比率来了解肿瘤DNA 拷贝数改变。
Array-based CGH 实际上有机地结合了芯片技术和CGH 技术二者的优势, 在保留了CGH 技术样本要求低、全基因组快速扫描等优点的同时, 解决了敏感性差、自动化程度低、操作复杂等技术问题。人们发展了各种平台用于支持 array CGH 研究，array CGH通常用于检测与癌症有关的体细胞片断改变，除此之外，还有很多用途，它可以用来测量癌症的拷贝数情况，研究遗传疾病和进化比较。并且可以在临床上作为诊断的工具[18]。
2.2 array CGH的应用
在最近几年，对与采用高通量array CGH研究拷贝数的改变，最初集中于癌症基因组的某一特殊区域，此后扩展到整个染色体臂上。Coe BP等人运用5p芯片包括491个BAC克隆研究了小细胞肺癌的细胞系[19]GarnisC等人运用全细胞覆盖比较基因组杂交的方法研究了口腔磷细胞癌症的3p染色体的复制数目的改变[20]Henderson LJ等人研究了小细胞肺癌的1p染色体臂再基因组和基因表达图谱上的细小的变化[21]。
片断复制和丢失是遗传疾病的主要原因，最近采用基于芯片的染色体比较基因组学对上述的基因改变进行了很多研究[22-24]。采用大量的插入基因组芯片用于描绘区域的改变对各种遗传疾病的影响。亚微观水平的染色体缺失和复制被证明在细胞遗传学正常的患者中显示又精神发育迟缓和体态反常。此外，使用array CGH研究拷贝数的改变还引起的Cri-du-chat综合症，先天性隔疝（CDH）和Prader–Willi综合症[25-27]。
array CGH 同样可以用于鉴别人类种群中的DNA拷贝数的变化。Iafrate等人使用了包括2632个插入克隆子，对55个不相关的个体进行基因变异的量化分析。结果表明，人类基因组上的255个位点包含有基因组的不平衡[28]。
2.3寡核苷酸阵列比较基因组杂交( oligonucleotide array CGH, oaCGH)
array CGH可分为两类，即BAC array CGH和cDNAarray CGH,目前应用最多的是BAC array CGH, 然而，这种方法存在许多不足，包括BAC克隆文库处理不易、PCR污染、BAC克隆在人基因组上的定位还不是百分之百准确、大多数独立的实验室没有能力制备分辨率为1Mb的BAC阵列尤其是全基因组BAC阵列等。近几年出现了寡核苷酸阵列比较基因组杂交技术，克服了原有array CGH 的不足。oa CGH的特点是以25～85mer的单链寡核苷酸为探针制备芯片。目前oa CGH平台包括Affymetrix平台、Agilent平台、NimbleGen 平台、非商业化自主平台等。寡核苷酸芯片的优点是，高灵敏度和特异度， oaCGH 的分辨率是BAC-array CGH 的至少500 倍。它同时具有探针及阵列设计灵活、成本效益高、可以针对全基因组或基因组的任何部分设计特异性探针,无需BAC array CGH中费时费力的基因扩增等操作,适于任何已知基因组序列的生物。
在过去的十年中，array CGH通过扩展芯片平台和它在各种基因研究中的应用而始终保持领先地位，新的芯片设计将持续提高其敏感性和清晰性，而对其进行提高其生产效率策略和改进计划将减少消耗并提高使用效率。新的软件和出现将提高这种方法的自动化水平，简化其数据的统计分析。新的技术改进和特异性数据库的增加将拓展array CGH在科学研究和临床使用的应用领域。
3 定向诱导基因组局部突变及其红外荧光检测技术
3.1 定向诱导基因组局部突变及红外荧光检测技术的结合
定向诱导基因组局部突变（TILLING： Targeting Induced Local Lesions In Genomes）技术，是利用化学突变方法来获得所有基因的传统的点突变等位基因系列。它将诱发产生高频率点突变的化学诱变方法与PCR筛选技术和Li-Cor 公司生产的4300 DNA遗传分析系统的双色红外荧光高通量检测技术有效结合，快速有效地从化学诱变剂（EMS）诱变产生的突变群体中鉴定出点突变，这一全新的、高通量、低成本的反向遗传学研究方法大大地方便了植物基因组学的研究。双色红外荧光检测技术是美国LI-COR公司的专利技术。LI-COR长期致力于此项技术在生物学研究中的应用，他们开发的Odyssey双色荧光扫描系统及DNA遗传分析系统都取得了很大成功。由于杂质、干扰分子在红外区几乎不发光，用红外荧光进行检测的背景非常低，灵敏度很高，可检测到低达15amoles的荧光分子。加上双通道检测（680nm激发，710nm检测；780nm激发，820nm检测），两个通道检测波长相距110nm，相对于通常的

图3 TILLING程序. (a) (1)使用特异性荧光标记基因的引物对获得的DNA进行复制 (2) 对复制产物进行加热变形接着缓慢冷却进行退火，使之能够随意重组。(3) 退火的双链DNA产物采用核酸酶进行消化并随之变性 (b) 使用聚丙烯酰胺凝胶检测片段，鉴定DNA种群。获得感兴趣的基因变异，
LI-COR凝胶系统使用两条通道鉴定 IRD700 和IRD800 染色分别标记50 和 30 PCR片断末端。切割片断的长度显示基因变异的位点。在这个例子中，变异发生在接近0.2kb的50末端复制子上，和接近0.8kb的30末端上。

可见荧光四色检测来说，保证了TILLING分析中每一个突变碱基的准确识别及整个检测的灵敏度。目前，LI-COR 检测系统被普遍的运用在TILLING研究项目中。
3.2 红外荧光检测技术在TILLING 中应用的优势
红外荧光检测技术在TILLING 中的应用优势。一是获得高质量的TILLING图像，将红外荧光检测技术与TILLING技术结合后，可以同时获得两张真实的电泳图像（700nm和800nm）。二是双色成像能有效排除假阳性突变通过PCR反应得到的异源核酸双链分子在碱基错配处被切断。同时，这两个突变条带的分子量之和应该等于野生型条带的分子量，因而双色检测能够有效排除假阳性点突变，准确度很高。三是高灵敏度的红外检测，红外荧光检测相对可见光检测具有背景低、灵敏度高的优点。此外，结合红外荧光染料后，该检测方法还具有另一个优点－宽广的线性范围。这一特点使得强信号和弱信号能够同时被分辨，当野生型条带的信号强，突变型条带信号弱时，LI-COR DNA分析系统也能够轻松识别突变。
3.3红外荧光检测技术在TILLING中的应用
目前，最通用的高通量筛选平台是使用LI-COR4300 DNA 分析系统进行筛选，Wienholds, E et al 报导了采用基于基因序列获得稳定斑马鱼Ragl 缺失突变体，为特异性免疫系统缺失的斑马鱼在生理生化方面变化和获得淋巴系统再生后可能的免疫系统功能水平的变化的研究提供了良好的模型[29]。Fred Hutchinson癌症研究中心，借助高通量的TILLING技术，利用6台自动加样的LI－COR凝胶分析系统，每8h进行2轮筛选，达到每天可检测大约10000拟南芥单株、筛选3个基因的惊人水平[30]。Draper也采用同样的方法对斑马鱼的诱变进行了研究[31]。
4展望
后基因组时代基因组学的研究热点转向基因功能，基因研究不仅是科研活动，而且蕴藏着巨大的市场和商机。功能基因组学将借助生物信息学的技术平台，利用先进的基因表达技术及庞大的生物功能检测体系，从浩瀚无垠的基因库筛选并确知某一特定基因的功能，通过比较分析基因及其表达的状态，确定基因的功能内涵，揭示生命奥秘，甚至开发出基因产品。伴随着功能基因组时代的到来，生物技术日新月异，推动着生命科学的高速发展，掌握和运用这些新技术是一个生物研究工作者在科研和产品开发中处于领先地位的关键，我国的科研工作者应当积极学习和掌握功能基因组学的前沿技术，发展用于功能基因组学研究的新技术，建立功能基因组学技术平台，抢占21世纪生命科学研究的制高点。

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