血红蛋白的提取和分离4.doc

课题3　血红蛋白的提取和分离
一、课题目标
本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。
二、课题重点与难点
课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。
课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。
三、课题背景分析
课题背景通过当今生物科学在蛋白质研究领域的进展，说明提取、分离高纯度的蛋白质的重要性和必要性，进而明确地提出课题目的：以血红蛋白为实验材料，学习蛋白质提取和分离的一些基本技术。可以发挥学生的主动性，让学生介绍当前有关蛋白质研究的新进展，激发学生的学习兴趣，然后指出本课题的学习意义，让学生初步体会分离纯化蛋白质的过程和方法。
四、基础知识分析与教学
（一）凝胶色谱法
知识要点：1.凝胶色谱法的用途；2.凝胶色谱法分离蛋白质的原理。
教学：在介绍凝胶色谱法的基本原理时，可以结合教科书提供的插图，让学生对凝胶色谱法分离蛋白质的过程有一个直观的认识。可以通过发动学生查阅资料，让学生了解有关凝胶色谱法的知识，如凝胶的种类、理化性质及凝胶的选择和保存，并结合实验操作，让学生分析实验中的注意事项。还可以向学生介绍凝胶色谱法的其他用途，如测定生物大分子的分子量、蛋白质的脱盐等。
（二）缓冲溶液
知识要点：1.缓冲溶液的组成和作用机理；2.熟悉一般缓冲溶液的配制方法；3．缓冲溶液广泛应用于生化实验、微生物的培养、组织切片和细菌染色以及酶的研究等方面。
教学：首先可以结合生活中的一些缓冲现象，让学生充分理解缓冲溶液的重要性。在进行本课题的实验操作之前，可以让学生查阅相关资料，练习一些常用缓冲液的配制。
（三）电泳
知识要点：1.电泳的基本原理；2.不同类型的电泳。
教学：电泳技术广泛应用于生化实验，在分离分析酶、蛋白质、核酸等生物大分子方面具有较高的分辨率。可以通过一个简单的实验使学生理解电泳现象，比如在盛有红褐色Fe(OH)3胶体的U形管的两个管口，各插入一个电极。通直流电后，发现阴极附近的颜色逐渐变深，阳极附近的颜色逐渐变浅。这表明Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，在电场作用下向阴极移动。这种在外加电场作用下，带电粒子发生迁移的现象就叫做电泳。
教科书中用楷体字简单地介绍了聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理，可以结合资料，开拓学生的知识面，围绕聚丙烯酰胺凝胶电泳，介绍其他类型的电泳原理及应用。本实验的选做部分是通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳对血红蛋白进行纯度的鉴定，同时也可以测定血红蛋白亚基的分子量。此外，还可以通过聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳来测定天然蛋白的分子量；通过聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳来测定蛋白的等电点；等等。相关原理可以查阅生物化学技术的有关书籍。
使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测出未知蛋白的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。
五、实验安排及注意事项
（一）第1课时完成基础知识的教学。需要用简单直观、通俗易懂的方式讲解凝胶色谱法和电泳的基本原理。可以根据学生的接受情况，适当增加一些相关知识的教学，加深对本课题的理解。第1课时还要学习缓冲溶液的配制。本课题所用的缓冲液是20 mmol/L的pH7.0的磷酸缓冲液。
在pH5.8～8.0的缓冲范围内，磷酸缓冲液的配制方法见下表。配制前需要准备0.2 mol/L的Na2HPO4溶液和0.2 mol/L的NaH2PO4溶液。Na2HPO4溶液的配制方法：将71.64 g的Na2HPO4·12H2O溶解在1 000 mL的蒸馏水中。NaH2PO4溶液的配制方法：将31.21 g的NaH2PO4·2H2O溶解在1 000 mL的蒸馏水中。
pH
0.2 mol/L
NaH2PO4/mL
0.2 mol/L
NaH2PO4/mL
pH
0.2 mol/L
NaH2PO4/mL
0.2 mol/L
NaH2PO4/mL
5.8
6.0
6.2
6.4
6.6
6.8
8.0
12.3
18.5
26.5
37.5
49.0
92.0
87.7
81.5
73.5
62.5
51.0
7.0
7.2
7.4
7.6
7.8
8.0
61.0
72.0
81.0
87.0
91.5
94.7
39.0
28.0
19.0
13.0
8.5
5.3
（二）第2课时进行凝胶色谱柱的制备。教材中已经详细地介绍了凝胶色谱柱的制作，可根据学生小组的数目，课前准备好所需的材料。值得一提的是，凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果，但是直径过大会造成洗脱液体积增大，样品的稀释度过大，因此应选择直径不超过2 cm的色谱柱。凝胶色谱柱的高度与分离度有关，一般不超过1 m。在装填凝胶前，一定要按教材描述的方法将凝胶充分溶胀，溶胀时可以用蒸馏水，也可以用洗脱缓冲液。如果发现凝胶的表面不平，可以用玻璃棒将表面的凝胶轻轻搅起，让其自然沉淀至表面平整。凝胶装填完毕一定要充分洗涤平衡，可以平衡过夜，但切记不得发生洗脱液流干、露出凝胶颗粒的现象，否则凝胶色谱柱需要重新装填。
（三）第3课时进行样品的处理。可以在课前从学校附近的屠宰场索取新鲜的猪血，切记要在采血容器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠。取血回来后，马上进行离心。血红蛋白溶液在透析袋中可以透析过夜。第2课时和第3课时在同一天进行，这样可使凝胶色谱柱的平衡和血红蛋白溶液的透析同时进行。
（四）第4课时进行血红蛋白的提取。此步骤是本课题的关键，每一步操作都要按照教科书的要求进行。加样前可以在样品中加入质量分数为1%的葡萄糖或蔗糖（糖不会干扰分离效果），以调节样品的比重，使之稍大于洗脱液，从而缩短加样时间。如果样品出现浑浊、有沉淀，可以离心或过滤后再加样。在实验过程中，洗脱液的流速也是影响分离效果的重要因素之一，因此，洗脱时应维持流速的恒定，即维持洗脱液加在色谱柱上的压力恒定。有条件的学校，可以在洗脱液瓶与凝胶色谱柱之间加一个蠕动泵来控制洗脱液的流速，以保持恒定。
（五）由于血红蛋白呈现红色，因此分离过程中能够观察到一条红色的带向下移动的现象，实验结果也一目了然。收集到红色的流出液就可以确定提取到了血红蛋白。有条件的学校，可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法鉴定血红蛋白的纯度。具体操作参见本课题参考资料。
（六）实验结果如果不理想,需要重做时，必须进行凝胶色谱柱的再生。一般情况下，凝胶不会与其他溶质发生任何作用，因此，在一次分离以后，稍加平衡就可以进行下一次的操作。平衡时，需用3倍柱体积的洗脱液过柱。如果实验操作中有一些杂质污染了色谱柱，可以用物质的量浓度为0.2 mol/L的氢氧化钠和物质的量浓度为0.5 mol/L的氯化钠混合液处理交联葡聚糖凝胶。如果凝胶长期不用，可以加入浓度为0.02%的叠氮钠、0.01% 的三氯丁醇和物质的量浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠等抑菌剂低温保存，使用时再进行充分的平衡。
六、课题成果评价
（一）是否完成对血液样品的处理
观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。
（二）凝胶色谱柱的装填是否成功。
由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。
（三）血红蛋白的分离是否成功
如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。