分子杂交的概念及基本原理.doc

分子杂交分子杂交的概念及基本原理主要内容：一、分子杂交的概念 二、分子杂交基本原理 （一）DNA变性： 1、DNA变性的方法2、增色效应3、溶解曲线4、融解温度5、影响Tm值的因素。 （二）复性：退火一、分子杂交的概念：分子杂交（molecular hybridization）指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。 利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。 二、分子杂交基本原理： （一）DNA变性： DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等）。 1、DNA变性的方法： 1)加热； 2)改变DNA溶液的pH； 3)有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素。 2、增色效应：DNA在260nm处有最大吸收值，这一特征是由于含有碱基的缘故。在DNA双螺旋结构模型中碱基藏于内侧，变性时由于双螺旋解开，于是碱基外露，260nm紫外吸收值因而增加，这一现象称为增色效应（hyperchromic effect）。利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化可追踪变性过程。 3、溶解曲线：如果升高温度使DNA变性，以温度对紫外吸收作图，可得到一条曲线，称为溶解曲线。 4、融解温度：通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度（即熔解曲线中点对应的温度），由于这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度（melting temperature， Tm）。因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度。 5、影响Tm值的因素：Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关： 1) 部因素：pH、离子强度。随着溶剂内离子强度上升，Tm值也随着增大。2) 部因素：DNA的碱基比例、DNA的均一性；在相同条件下，DNA内G-C配对含量高，其Tm值也高。 6、DNA中的GC含量与Tm值关系： Tm = 69。3 0。41 % （G C） 对于小于20bp的寡核苷酸，Tm=4（G C） 2（A T） 实验表明DNA分子中（G C）克分子含量百分比的大小与Tm值的高低呈直线关系。 （二）复性：变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性（renaturation）。 退火：通常DNA热变性后，将温度缓慢冷却，并维持在比Tm低2530左右时，变性后的单链DNA即可恢复双螺旋结构，因此，这一过程又叫做退火。 复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。倘若DNA热变后快速冷却，则不能复性。 影响复性速度的因素： 1、DNA浓度：愈高，复性速度也愈快。 2、DNA片段的大小：DNA片段愈大，扩散速度愈低，使DNA片段线状单链互相发现互补的机会减少。因此，在复性实验中，有时将DNA切成小片段，再进行复性。 3、温度：过高不利于复性。 4、溶液的离子强度：通常盐浓度较高时，复性速度较快。 5、DNA顺序的复杂性；简单的分子复性很快，如polydT和polydA由于彼此互补识别很快，故能迅速复性。但顺序较复杂的DNA分子复性则较慢。因此通过变性速率的研究，可以了解DNA顺序的复杂性。核酸探针 主要内容：一、探针的概念 二、探针的种类极其选择： 1、DNA探针， 2、cDNA 探针， 3、RNA探针， 4、寡核酸探针 三、各种标记物极其选择 四、核酸探针的标记方法 五、杂交信号检测 一、探针的概念： 放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记的已知序列的核酸片段，即为探针（probe）。探针可用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。二、探针的种类极其选择： 基因探针根据标记物不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类； 根据探针的来源及核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针，及寡核苷酸探针等几类。 1、DNA探针： DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。 DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。 DNA探针（包括cDNA探针）的优点： 这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。 不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。 DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法等，能用于同位素和非同位素标记。2、cDNA 探针： cDNA （complementary DNA）探针是指互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的。该酶以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA（其中U与A配对）。 cDNA 探针是目前应用最为广泛的一种探针。 3、RNA探针： RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受到多种因素的制约。这类RNA探针主要用于研究目的，而不是用于检测。 克隆探针： 前述三种探针均是可克隆的，一般情况下，只要有克隆的探针，就不用寡核苷酸探针。在DNA序列未知而必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序时，也常应用克隆。32PdATP标记。 （二）、非放射性标记： 放射性标记核酸探针在使用中的限制，促使非放射性标记核酸探针的研制迅速发展，在许多方面已代替放射性标记，推动分子杂交技术的广泛应用。目前已形成两大类非放射标记核酸技术，即酶促反应标记法和化学修饰标记法。 1、酶促反应标记法： 将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶促反应将核苷酸分子掺入到探针分子中去。 ）标记物-dUTP的生成：如Bio-11-dUTP、Dig-11-dUTP。 ）通过缺口平移法、末端加尾标记和随机引物延伸法将标记物-dUTP作为大肠杆菌多聚酶I（DNA酶I）的底物掺入到DNA分子中。 2、化学修饰标记法： 利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团发生的化学反应将标记物直接结合到探针分子上。 如可通过连接臂将一个光敏基团连接于生物素成为光敏生物素，在可见光的作用下，与核酸形成稳定的交联，从而得到光敏生物素探针。五、杂交信号检测： （一）放射自显影：利用放射线在X线片上成影作用来检测杂交信号，称为放射自显影。 （二）非放射性核素探针的检测： 1、偶联反应： （1）半抗原通过抗原-抗体反应与显色体系偶联。 （2）配体亲和法与显色体系偶联：生物素-抗生物素蛋白-酶（Avidin-Biotin-Enzyme-Complex ，ABC） 2、显色反应： 通过连接在抗体或生物素蛋白的显色物质如酶、荧光素等进行杂交信号的检测。 （1）酶学检测： 是最常用的检测方法，通过酶促反应使底物形成有色产物。最常用的酶是辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶，也有使用酸性磷酸酶和 半乳糖苷酶。 1）辣根过氧化物酶（ HRP ）检测体系：AKP灵敏度和分辨率较HRP高约10倍左右，但HRP的优点为价廉、稳定。 （2）荧光检测： 常用的有异硫氰酸荧光素（FITC）和罗丹明，可被紫外线激发出荧光而被检测到。主要应用于原位杂交。 （3）化学发光法： 是指在化学反应过程中伴随的发光反应。目前常用的是辣根过氧化物酶（ HRP ）催化鲁米诺（luminol）伴随的发光反应。适合于Southern、Northern及斑点杂交。 （4）电子密度标记： 利用重金属的高电子密度、在电子显微镜下进行检测，适合于细胞原位杂交。 核酸分子杂交的类型 核酸分子杂交可按作用环境大致分为液相杂交和固相杂交两种类型。 液相杂交：液相杂交指所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。液相杂交是一种研究最早且操作复合的杂交类型，在过去的30年里虽有时被应用，但总不如固相杂交那样普遍。其主要原因是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高。 固相杂交：固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在溶液中。由于固相杂交后，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点，故该法最为常用。根据支持物的不同固相杂交又可为：滤膜杂交、菌落原位杂交和组织原位杂交。重点介绍： 一、印迹杂交 （一）印迹杂交技术的基本过程： （二）印迹转移的方法 （三）印迹杂交的类别及应用 1、Southern印迹杂交、 2、Northern印迹杂交， 二、斑点杂交、狭缝杂交， 三、菌落原位杂交、 四、组织原位杂交等。一、印迹杂交：（一）印迹杂交技术的基本过程： 印迹杂交技术的原理首先由Edwen Southern在1975年提出。其基本操作过程是： 1、核酸的制备； 2、电泳：将DNA片段在琼脂糖凝胶中电泳分离； 3、变性：置NaOH液中浸泡，从而将凝胶中的DNA变性为单链； 4、印迹：利用吸水纸巾的毛细管作用，将单链DNA从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，再将膜置80烘干并使单链DNA分子固定在膜上； 5、预杂交：减少非特异性杂交反应。 6、杂交： 7、洗膜： 8、检测：（二）印迹转移的方法：将凝胶中的核酸片段印迹到滤膜的方法有：1、虹吸印迹法2、电转移印迹法3、真空印迹法1、虹吸印迹法：利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移至滤膜上。电泳后的凝胶变性中和放置室温转移1520h 漂洗80烘烤2h固定核酸2、电转移印迹法： 利用电泳作用将凝胶中的DNA转移至滤膜上，是一种快速、简单、高效的转移法，只需几小时，特别适用虹吸转移法不理想的大片段的转移。电转移法使用的滤膜有一定的限制，只能用尼龙膜或化学活化膜，不能用硝酸纤维素膜。因为硝酸纤维素膜结合DNA依赖于高浓度盐溶液，高盐溶液的导电性极强，产生强大的电流，使转移体系的温度急剧升高，破坏DNA。 3、真空印迹法： 利用真空泵将转移缓冲液从上层容器中通过凝胶抽到下层真空室中，同时带动核酸分子转移到凝胶下面的滤膜上，整个过程只需1小时左右。 （三）印迹杂交的类别及应用： 1、DNA印迹杂交技术： Southern blotting 2、RNA印迹杂交技术：正好与DNA相对应，故被趣称为Northern blotting 3、蛋白质印迹杂交技术则被称为Western blotting。其中最常用的是用抗体来检测，也称为免疫印迹技术（immunoblotting）。 1、DNA印迹杂交技术： DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术（Southern blotting）。 基因组DNA 限制性内切酶 DNA变性电泳印记转移预杂交 （探针）杂交洗膜放射自显影或化学显色。 2 RNA印迹杂交： 这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 RNA的提取 RNA变性电泳印记转移预杂交 （探针）杂交洗膜放射自显影或化学显色。 1）RNA分子较小，不需进行限制性内切酶切割； 2）在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2-羟基基团；3）在转印后不能用低盐缓冲液洗膜，否则RNA会被洗脱； 4）在胶中不能加EB，因它为影响RNA与硝酸纤维素膜的结合；5）操作均应避免RNase的污染。二斑点杂交（Dot blot）： 将核酸样品变性后直接点样于滤膜上，烤干或紫外线照射以固定标本，然后与探针进行杂交的方法称斑点杂交或狭缝杂交。斑点印迹为斑点状，狭缝印迹为线状。 斑点杂交耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。多用于病原体基因，如微生物的基因，但也可用于检查人类基因组中的DNA序列。 三菌落原位杂交： 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。 四组织原位杂交： （一）原理： 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。 （二）应用： 1、对致密染色体DNA的原位杂交可用于显示特定的序列的位置； 2、对分裂期间核DNA的杂交可研究特定序列在染色质内的功能排布； 3、与细胞RNA的杂交可精确分析任何一种RNA在细胞中和组织中的分布； 4、原位杂交还是显示细胞亚群分布和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。 （三）探针选择： 用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA，也可以是RNA探针。通常探针的长度以100400bp为宜，过长则杂交效率减低。最近研究结果表明，寡核苷酸探针（1630bp）能自由出入细菌和组织细胞壁，杂交效率明显高于长探针。因此，寡核苷酸探针和不对称PCR标记的小DNA探针或体外转录标记的RNA探针是组织原位杂交的优选探针。（四）探针的标记： 探针的标记物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等。 放射性同位素中，3H和35S最为常用。 3 H标记的探针半衰期长，成像分辨率高，便于定位，缺点是能量低。 35 S标记探针活性较高，影像分辨率也较好。 32 P能量过高，致使产生的影像模糊，不利于确定杂交位点。 （五）组织与细胞的固定： 原位杂交中，标本的固定条件是影响杂交效率的重要因素，标本组织蛋白质的消化程度对探针进入细胞极为重要。去除蛋白的方法是，用0。2mol/L HCl处理载玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同浓度的乙醇脱水，原位杂交还是一种新技术，发展很快，在敏感性、特异性和稳定性上还需要进一步完善和提高。核酸分子杂交实验因素的优化（一）探针的选择： 根据不同的杂交实验要求，应选择不同的核酸探针。在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针。但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。 1、检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针； 2、在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针（通过克隆人M13噬菌体DNA获得）或RNA探针，寡核苷酸探针也可； 3、检测复杂的靶核苷酸序列和病原体应选用特异性较强的长的双链DNA探针； 4、组织原位杂交应选用寡核苷酸探针和短的PCR标记探针（80150bp），因为它易透过细胞膜进入胞内或核内。 （二）探针的标记方法： 在选择探针类型的同时，还需要选择标记方法。探针的标记方法很多，选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定。但在选择标记方法时，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。 放射性探针的实际灵敏度不依赖于所采用的标记方法，如随机引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性。在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统。 （三）探针的浓度： 随探针浓度增加，杂交率也增加。在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。要获得较满意的敏感性，膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为510 ng/ml和251000ng/ml，而原位杂交中，无论应用何种标记探针，其用量均为0.55.0g/ml。探针的任何内在物理特性均不影响其使用浓度，但受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影响。 （四）杂交率： 传统杂交率分析主要用于DNA复性研究，在这种情况下，探针和靶链在溶液中的浓度相同。现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在探针过剩的条件下进行，此外，固相杂交中靶序列不在液相，故其浓度不能精确计算。 （五）杂交最适温度： 杂交技术最重要的因素之一是选择最适的杂交反应温度。若反应温度低于Tm的 1015，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低（Tm-30），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。如两个同源性在50%左右或更低些的DNA，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。 （六）杂交的严格性： 影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严格性。一般认为在低于杂交体Tm值25时杂交最佳，所以首先要根据公式计算杂交体Tm 值。通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。（七）杂交反应时间：在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行20h左右。（八）杂交促进剂：体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。对单链探针可增加3倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。而短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小，短探针本身的杂交率就高。10