冻害胁迫下马铃薯叶片中生物碱类物质研究.pdf

云南师范大学学报(自然科学版),2 0 2 3,4 3(5):1 9-2 4 h t t p s:/q k g j.y n n u.e d u.c nJ o u r n a l o fY u n n a nN o r m a lU n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c e sE d i t i o n)D O I:1 0.7 6 9 9/j.y n n u.n s-2 0 2 3-0 6 1冻害胁迫下马铃薯叶片中生物碱类物质研究*刘香,暴会会,张镇杰,杨福丽,罗永超,祝光涛*(云南师范大学 生命科学学院,马铃薯科学研究院,云南省马铃薯生物学重点试验室,云南 昆明6 5 0 5 0 0)摘要:以耐寒性野生马铃薯材料S o l a n u mc o mm e r s o n i i和冷冻敏感材料S t G pP h u r e j a作为研究对象,4驯化3d后-3冻害处理3h、6h、1 2h进行转录组和代谢组测序及相关分析.研究表明,生物碱类物质是这两个马铃薯品种有差异的主要代谢产物类别之一,对其抗寒性有重要影响.在马铃薯耐寒材料中有1 2个差异生物碱类代谢物响应低温胁迫.根据这1 2个核心差异代谢物进行关联分析筛选出2 7个转录因子与之有相似的表达模式,这些转录因子可能参与生物碱的调控.关键词:马铃薯;转录组;代谢组;生物碱;低温中图分类号:S 5 3 2 文献标志码:A 文章编号:1 0 0 7-9 7 9 3(2 0 2 3)0 5-0 0 1 9-0 6 马铃薯作为世界第四大粮食作物,在全世界范围内被广泛种植,我国马铃薯种植地域广泛,且一年四季均有种植,但生产中容易遭受低温寒害,严重影响产量甚至绝收1.目前,我国生产上广泛使用的马铃薯品种为马铃薯普通栽培种(S o l a-n u mt u b e r o s u m),多为2 0世纪从国外引进的品种或近缘杂交种,品种间遗传多样性较低,遗传背景狭窄2.前人对我国审定的1 1 5个主要的马铃薯栽培品种进行了抗寒能力评价,结果显示这些品种几乎都不耐低温霜冻,仅有“晋薯2号”等少数几个品种具有较微弱的抗寒能力3.生物碱是一种生物活性较强的含氮化合物,主要分为糖苷生物碱(S GA)、烟碱(尼古丁)、萜类吲哚生物碱(T I A s)和异喹啉生物碱(B I A s)4.参与生物碱生物合成的转录因子家族有乙烯响应元件 结 合 因 子(A P 2/E R F)、碱 性 螺 旋 环 螺 旋(b HLH)、碱性亮氨酸拉链(b Z I P)、Z C T、MY B和WR K Y等,其中A P 2/E R F和b H L H是参与生物碱合成的主要转录因子家族5-8.研究表明,外施茉莉酸(J A)或者茉莉酸甲酯(M e J A)会诱导植物中S GA和烟碱等生物碱的积累6,9.但植物中过量的生物碱对人体有害,例如食用S GA含量高的马铃薯块茎会有麻口或中毒的情况出现,因此需要平衡农作物中的生物碱含量,培育出抗逆性强、安全、优质的农作物品种,如块茎S GA含量低而地上部S GA含量高的马铃薯品种,低S GA含量的马铃薯块茎保证食用安全,高S GA含量的马铃薯地上部可以增强植株的抗逆能力.为此需深入研究生物碱的生物合成机制,为调控农作物中生物碱含量提供理论依据,以期培育出抗逆性强、安全和优质的农作物品种.以马铃薯抗寒性材料和敏感性材料为研究对象,在低温胁迫条件下,通过转录组学和代谢组学等方法,筛选出与抗寒性相关的关键生物碱类化*收稿日期:2 0 2 3-0 8-1 4基金项目:国家重点研发计划资助项目(2 0 2 2 Y F F 1 0 0 2 5 0 0).作者简介:刘香和暴会会具有相同贡献.刘香(2 0 0 2-),女,云南曲靖人,主要从事马铃薯抗寒组学方面研究;暴会会(1 9 9 5-),女,河南濮阳人,博士研究生,主要从事马铃薯分子育种与基因组学方面研究.通信作者:祝光涛.E-m a i l:z h u g u a n g t a o 0 5 3 61 2 6.c o m.合物,并进一步挖掘与马铃薯抗寒相关的基因,从而为进一步阐明马铃薯抗寒性的分子机理、发掘抗寒性相关基因、选育抗寒性优良的马铃薯新品种奠定基础.1 材料与方法1.1 马铃薯材料处理以耐寒野生材料S.c o mm e r s o n i i(CM)与冷冻敏感材料S t G pP h u r e j a(DM)作为研究对象.在(2 01)的温度下,将实验材料于M S培养基(3%蔗糖和0.3 1%琼脂)上培养2周.随后将2周龄的组培苗移栽到塑料盆中,并在云南师范大学马铃薯研究院的植物生长气候室中以1 6h光照/8h黑暗光照周期,(2 22)的条件进行栽种.1.2 低温处理将正常条件下生长的4周龄植株移入4冷室中,在1 6h光照/8h黑暗光照周期下进行3d的低温驯化,然后将驯化后的植株在-3 下处理3h、6h、1 2h,以光周期一致、正常条件下生长的驯化植株作为对照.每个处理时间1 5个生物学重复计算存活率.1.3 代谢组学分析取不同低温处理时间的实验材料幼苗叶片,每组3个生物学重复,测定代谢组.根据O P L S-D A模型,从中获得的具有统计学意义的可变影响投影阈值(V I P)和单变量分析的倍数变化(F C)来选择两个样本的差异代谢物.其中V I P1.0,F C1.5或F C0.6 7被认为是差异代谢物.利用迈维生信云平台对代谢组的生物碱含量绘制热图,可用于分析两样本在不同处理时间下生物碱的表达量水平变化.使用E x c e l计算差异倍数得到差异代谢物,运用O r i g i n软件对数据结果绘制差异物质堆积图,用于分析两样本在不同处理时间下差异代谢物上调与下调变化.1.4 转录组测序和差异表达基因挖掘为了研究低温胁迫下DM和CM转录水平的变化,每个样本3个生物学重复使用R NA p r e p多酚植物总R NA提取试剂盒提取总R NA,根据I l l u m i n a说明,使用1 0 0n g R NA构建R NA-s e q文库.利用逆转录酶I I(I n v i t r o g e n)合成第一链c D NA.在第二链c D NA合成和接头连接后,c D-NA片段被富集、纯化,然后在I l l u m i n aH i s e qXT e n上测序.使用H I S AT 2将干净读数映 射到DM(v 6.1)参考基因组.用P0.9 5,P 0.0 1,P e a r s o n),绘制相关性网络图(图5).结果表明去氢番茄碱关联最多 转 录 因 子,转 录 因 子A B A r e p r e s s o r1(A B R 1-l i k e)关联最多代谢物.根据差异代谢物筛选出2 7个转录因子可能参与生物碱的调控,如b HLH 7 1-l i k e、E R F 0 5 4、MY B 3 0、b r a s s i n o l i d ee n-h a n c e de x p r e s s i o n(B E E1-l i k e)、t a r g e to fe a t3(TO E 3)和T C P 1 3-l i k e等,可作为马铃薯抗寒候22云南师范大学学报(自然科学版)第4 3卷 选基因进行下一步研究.红线为正相关,蓝线为负相关.图5 代谢物基因网络图F i g.5 M e t a b o l i t eg e n en e t w o r kd i a g r a m3 讨论马铃薯在低温胁迫初期时植株本能地产生自我保护性应急反应,使相关抗寒调节物质活性逐渐增强,在低温胁迫中期时,植株适应了低温胁迫,建立起自身防御体系,相关抗寒调节物质活性达最高水平,随着低温胁迫时间的延长,超过某个耐受时间节点,低温伤害会超越植物本身的防御保护能力1 0.本研究中耐寒野生马铃薯品种CM受到低温胁迫后,生物碱含量会快速上调,这种上调很稳定,DM在低温处理1 2h后,植株死亡,即是超过了耐受节点,未能建立起防御体系,说明生物碱是马铃薯抗寒调节物质之一,在抵御低温胁迫方面起到重要作用.生物碱是存在于植物体内的碱性含氮有机化合物,是植物中广泛存在的一种次生代谢产物,植物被这些天然产生的含氮化合物包裹起来,以对抗许多具有挑战性的环境胁迫1 1.这种特殊的代谢物在植物的不同组织(如叶、茎、根、花、种子、果实和贮藏器官)中有不同程度的存在1 2.相比其他代谢产物,生物碱生物合成过程 复 杂,有 较 多 的 酶 和 转 录 因 子 参 与 其中1 3.本研究得到的1 2种关键差异生物碱多为茄碱和烟碱衍生物,它们在CM样本抗寒中发挥着重要作用.通过转录组学分析得到的2 7个转录因子则可能在这些生物碱的合成过程中发挥着重大作用,但关于这些转录因子如何进行生物碱的调控还待进一步出探索.总之,研究马铃薯在低温胁迫下的生物碱生物合成,挖掘参与生物碱合成的有关转录因子可为探索马铃薯耐寒机制及耐寒品种的早期选育提供理论依据.4 结语此次试验在耐寒材料中找到的1 2种差异代谢物生物碱,分别是去氢番茄碱、s n-甘油-3-磷酸胆碱、甘磷酸胆碱、h a b r o c h a i t o s i d eA、澳洲茄胺、二羟基番茄次碱-O-己糖基-O-戊糖苷、新烟碱-葡萄糖苷、烟碱-N-葡萄糖苷、3-氨基甲酰-1-甲基氧化吡啶、D L-2-氨基己二酸和肉桂酰酪氨酸.根据差异代谢物筛选出2 7个转录因子可能参与生物碱的 调 控,如b HLH 7 1-l i k e、E R F 0 5 4、MY B 3 0、B E E1-l i k e、TO E 3和T C P 1 3-l i k e等.参考文献:1 舒启琼,罗小波,李飞,等.马铃薯抗寒研究进展J.植物生理学报,2 0 2 1,5 7(6):1 1 7 1-1 1 7 8.2 寇爽,涂卫,赵喜娟,等.马铃薯普通栽培种杂交后代抗寒性分析J.中国马铃薯,2 0 1 5,2 9(5):2 5 7-2 6 2.3 董建科,涂卫,赵庆浩,等.马铃薯产业与健康消费:国内主要马铃薯品种(系)抗寒性鉴定M.哈尔滨:黑龙江科学技术出版社,2 0 1 9.4 F A C CH I N IPJ.A l k a l o i db i o s y n t h e s i s i np l a n t s:b i o-c h e m i s t r y,c e l lb i o l o g y,m o l e c u l a rr e g u l a t i o n,a n dm e t a b o l i ce n g i n e e r i n g a p p l i c a t i o n sJ.A n n u R e vP l a n tP h y s i o lP l a n tM o lB i o l,2 0 0 1,5 2:2 9-6 6.5 C R D E NA SPD,S ONAWAN EPD,P O L L I E RJ,e t a l.G AME 9r e g u l a t e s t h eb i o s y n t h e s i so fs t e r o i d a la l k a l o i d sa n du p s t r e a mi s o p r e n o i d s i nt h ep l a n tm e-v a l o n a t ep a t h w a yJ.N a tC o mm u n,2 0 1 6,7:1 0 6 5 4.6 THA GUN C,I MAN I S H IS,KU D O T,e ta l.J a s-m o n a t e-r e s p o n s i v eE R Ft r a n s c r i p t i o nf a c t o r sr e g u-l a t es t e r o i d a lg l y c o a l k a l o i db i o s y n t h e s i si nt o m a t o32 第5期 暴会会,等:冻害胁迫下马铃薯叶片中生物碱类物质研究J.P l a n tC e l lP h y s i o l,2 0 1 6,5 7(5):9 6 1-9 7 5.7 GUC,GUOZH,HAO PP,e t a l.M u l t i p l e r e g u l a t o-r yr o l e so fA P 2/E R Ft r a n s c r i p t i o nf a c t o ri na n g i o-s p e r mJ.B o t a n i c a lS t u d i e s,2 0 1 7,5 8(1):6.8 D E NGXB,Z HAOL,F AN GT,e ta l.I n v e s t i g a t i o no fb e n z y l i s o q u i n o l i n ea l k a l o i db i o s y n t h e t i cp a t h w a ya n d i t s t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o ni nl o t u sJ.H o r t i-c u l t u r eR e s e a r c h,2 0 1 8,5:2 9.9 S UT T I P AN T A N,P A T TANA I KS,KU L S HR E S-THA M,e ta l.T h et r a n s c r i p t i o nf a c t o rC r WR KY 1p o s i t i v e l y r e g u l a t e s t h e t e r p e n o i d i n d o l e a l k a l o i db i o-s y n t h e s i s i nC a t h a r a n t h u s r o s e u sJ.P l a n tP h y s i o l o-g y,2 0 1 1,1 5 7(4):2 0 8 1-2 0 9 3.1 0YAMA D A Y,N I S H I D AS,S H I T AN N,e ta l.G e-n o m e-w i d e i d e n t i f i c a t i o no fA P 2/E R Ft r a n s c r i p t i o nf a c t o r-e n c o d i n gg e n e si nC a l i f o r n i ap o p p y(E s c h s c h o l z i ac a l i f o r n i c a)a n d t h e i r e x p r e s s i o np r o-f i l e s i nr e s p o n s et om e t h y l j a s m o n a t eJ.S c i e n t i f i cR e p o r t s,2 0 2 0,1 0:1 8 0 6 6.1 1许娟,郑虚,闫海锋,等.不同马铃薯品种苗期叶片对低温胁迫的生理响应J.南方农业学报,2 0 1 6,4 7(1 1):1 8 3 7-1 8 4 3.1 2熊安平,姜艳芳,彭亚丽,等.调控植物生物碱生物合成的转录因子研究进展J.分子植物育种,2 0 2 1,1 9(1 7):5 7 2 0-5 7 2 8.1 3B HAMB HAN IS,KON DHA R EKR,G I R IAP.D i-v e r s i t y i nc h e m i c a l s t r u c t u r e sa n db i o l o g i c a lp r o p e r-t i e so fp l a n ta l k a l o i d sJ.M o l e c u l e s,2 0 2 1,2 6(1 1):3 3 7 4.S t u d yo nA l k a l o i d s i nP o t a t oL e a v e su n d e rF r e e z i n gS t r e s sL I UX i a n g,B A OH u i h u i,Z H A N GZ h e n g j i e,Y A N GF u l i,L U OY o n g c h a o,Z H UG u a n g t a o*(Y u n n a nP r o v i n c i a lK e yL a b o r a t o r yo fP o t a t oB i o l o g y,P o t a t oS c i e n c eR e s e a r c hI n s t i t u t e,S c h o o l o fL i f eS c i e n c e,Y u n n a nN o r m a lU n i v e r s i t y,K u n m i n g6 5 0 5 0 0,C h i n a)A b s t r a c t:I nt h i ss t u d y,t h ec o l d-t o l e r a n tw i l dp o t a t ov a r i e t yS.c o mm e r s o n i ia n dt h ef r e e z e-s e n s i t i v es p e c i e sS t G pP h u r e j aw e r eu s e da sm a t e r i a l s.T h e t r a n s c r i p t o m ea n dm e t a b o l o m es e q u e n c i n ga n dc o r-r e l a t i o na n a l y s i sw e r e c o n d u c t e da f t e r a c c l i m a t i o na t 4f o r 3da n d f r e e z i n g t r e a t m e n t a t-3f o r 3h,6ha n d1 2h.T h er e s u l t ss h o w e dt h a ta l k a l o i d sw e r eo n eo ft h em a i nm e t a b o l i t e st h a tl e dt ot h ed i f f e r e n c eo f l o wt e m p e r a t u r e t o l e r a n c eb e t w e e nt h e t w op o t a t ov a r i e t i e s,a n dh a da ni m p o r t a n te f f e c to nt h e i rc o l dr e s i s t a n c e.T h e r ea r e1 2d i f f e r e n t a l k a l o i dm e t a b o l i t e s i nt h ec o l dr e s i s t a n tm a t e r i a l s t h a tp l a yt h er o l eo f c o l dr e s i s t a n c e.A c c o r d i n gt ot h e1 2c o r ed i f f e r e n t i a lm e t a b o l i t e s,2 7t r a n s c r i p t i o nf a c-t o r sw e r es e l e c t e db ya s s o c i a t i o na n a l y s i sw i t hs i m i l a re x p r e s s i o np a t t e r n s,w h i c hm a yb e i n v o l v e di nt h er e g u l a t i o no f a l k a l o i d s.K e y w o r d s:P o t a t o;T r a n s c r i p t o m e;M e t a b o l o m e;A l k a l o i d;L o wt e m p e r a t u r e42云南师范大学学报(自然科学版)第4 3卷