土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(已用)(课堂PPT).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,课题2,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,专题2,微生物的培养与应用,1,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素,不能,直接被农作物吸收。土壤中的细菌将,尿素分解成氨,之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成,脲酶,CO(NH,2,),2,脲酶,+H,2,O,+CO,2,2NH,3,3、本课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,2,1、实例：,启示,：寻找目的菌种时要根据它对,生存环境,的要求，到,相应的环境中,去寻找。,原因,：因为热泉温度7080,0,C，淘汰了绝大多数微生物只有耐热的Taq细菌被筛选出来。,DNA多聚酶链式反应（PCR)是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（93,0,C）的,DNA聚合酶,。,一、研究思路,筛选菌株,统计菌落数目,设置对照,3,要分离一种微生物，必须根据,该微生物的特点,，包括,营养,、生理、,生长条件,等；,方法：,抑制,大多数微生物的生长,造成,有利于,该菌生长的环境,结果：,培养一定时间后，该菌数量上升，再通过,平板划线法,或,稀释涂布平板法,等方法对它进行纯化培养分离。,2、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于,目的菌株生长的条件,(包括,营养、温度、pH,等)，同时,抑制或阻止,其他微生物生长。,选择,培养基：,在微生物学中，将允许,特定种类的微生物,生长，同时,抑制或阻止,其他种类微生物生长的,培养基。,4,15.0g,琼脂,1.0g,尿素,10.0g,葡萄糖,0.2g,MgSO,4,7H,2,O,2.1g,NaH,2,PO,4,1.4g,KH,2,PO,4,3、土壤中,分解尿素的细菌,的分离与计数所需培养基：,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：,葡萄糖、尿素,氮源：,尿素,思考1,5,从物理性质看此培养基属于,培养基，是由于加入了凝固剂,。,从功能上看属于,培养基，此培养基的,只有尿素，能利用尿素的微生物可分泌脲酶，因此能在此培养基上生长，此培养基属于,培养基。,思考2该培养基对微生物,（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是,。,具有,只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长,选择,固体,琼脂,选择,氮源,思考3,15.0g,琼脂,1.0g,尿素,10.0g,葡萄糖,0.2g,MgSO,4,7H,2,O,2.1g,NaH,2,PO,4,1.4g,KH,2,PO,4,6,培养基的氮源为尿素，只有能合成,脲酶,的微生物才能分解尿素，以,尿素,作为氮源。缺乏,脲酶,的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出,分解尿素,的微生物。,4、培养基选择分解尿素的微生物的原理,15.0g,琼脂,1.0g,尿素,10.0g,葡萄糖,0.2g,MgSO,4,7H,2,O,2.1g,NaH,2,PO,4,1.4g,KH,2,PO,4,7,活学活用,1.,在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出(),A.乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌,B.固氮细菌、大肠杆菌、放线菌,C.固氮细菌、霉菌、放线菌,D.固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌,C,8,（1）,原理：,当样品的,稀释度足够高,时，培养基表面生长的一个菌落，,来源于样品稀释液中的,一个,活菌。通过统计平板上的,菌落数,，就能推测出样品中大约含有多少活菌。,（2）常用方法：,稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M,其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,（二）统计菌落数目：,1.,活菌计数法,（3）计算公式：,（间接计数法,）,9,想一想，如何根据平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？,统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上的菌落数的平均值，然后按以下公式进行计算。,旁栏思考题,每克样品中的菌落数(CV)M,其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,10,实例分析P22,第二位同学,的统计结果更接近真实值。因为第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。,你认为哪个同学的结果更接近真实值？,你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？,都需要,。,第一位同学在该浓度下可以多涂布几个平板,；第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是其中1个平板的计数结果与另外2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值，,可以在该浓度下重新进行实验。,11,注意事项,为了保证结果准确，一般选择菌落数在,30300的平板,上进行计数。,为使结果接近真实值可将,同一稀释度涂布三个或三个以上的平板,，培养统计菌落数，计算出菌落平均值。,统计的菌落往往比活菌的实际数目,低,。,恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键，,一般以三个稀释度,中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右时为最好。,12,2、显微镜直接计数：,利用,血球计数板,，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,（二）.统计菌落数目：,不能区分死菌与活菌；,不适于对运动细菌的计数；,需要相对高的细菌浓度；,个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,13,将含,已知数目的红细胞,液体与,待测的菌液,按1：1均匀混合，在显微镜下,数出各自的数目,，然后求菌液中的细胞数目。,（比例计数法，类似与标志重捕法）,待测样品,等量的已知含量的红细胞,混匀,涂抹,测定：,红细胞数目,细菌数目,计算单位体积内的细菌数目,细菌,红细胞,【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。,14,举例：已知红细胞浓度为M个/mL，从体积为N mL的大肠杆菌培养液中取出大杆菌液与红细胞液,等量均匀混合,后，涂片，染色，镜检。在同一视野中发出有红细胞W个，大肠杆菌Y个，求NmL大肠杆培养液中大肠杆菌的个数X是多少？,XN,M Y,W,(个),观察到的红细胞平均数/观察到的细菌平均数,红细胞含量/细菌含量,（类似于标志重捕法）,公 式,W/Y M/X(每mL中）,NmL大肠杆培养液中大肠杆菌的个数X为：,15,2.,用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。在某稀释浓度下某同学做了若干个平板并统计每个平板的菌落数，最接近样品中菌体数真实值的是(),A.菌落数量最多的平板,B.菌落数量最少的平板,C.菌落数量适中的平板,D.取若干个平板菌落数量的平均值,D,活学活用,16,设置对照,的主要目的是,排除实验组中非测试因素对实验结果的影响,，提高实验结果的可信度。,（三）,设置对照：,设置对照的方法：,空白对照：,不给对照组任何处理,因素；,条件对照：,给对照组施以部分实验因素，但,不是所要研究的处理因素,；,自身对照：,对照组和实验组,都在同一研究对象,上进行；,相互对照：,不单设对照组，而是,几个实验组相互对照,。,17,教材提供的案例中A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种：,一是,由于土样不同,；,二是,由于培养基污染或操作失误,。,如何设置对照实验来确定原因？,方案一：,其他同学用,与A同学一样,的土样进行实验。,如果结果,与A同学一致,，则证明A同学,操作无误,；,如果,结果不同,，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,实例：教材P23,18,教材提供的案例中A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种：,一是,由于土样不同；,二是,由于培养基污染或操作失误。,如何设置对照实验来确定原因？,方案二：,将A同学配制的培养基在,不加土样的情况下进行培养，作为空白对照,，以证明培养基是否受到污染。,实例：教材P23,小结：,通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，,对照实验,的设置是必不可少的。,19,9,20,实验设计：,实验设计包括对,实验方案,，所需,仪器,、,材料,、,用具,和,药品,，具体的实施,步骤,以及时间安排等的综合考虑和安排。,21,二实验设计与操作,下面是土壤中尿素分解菌的分离与计数的实验流程示意图，请结合教材提供的资料，进行实验设计，并写出详细的实验方案：,22,菌落计数,配制土壤溶液,系列稀释,涂布平板与培养,实验设计：,实验方案：,23,（一）土壤取样,（三）样品的稀释,（四）取样涂布,（五）微生物的培养与观察并计数,（六）鉴定,实验的具体操作,（二）制备培养基：,24,应在,火焰旁,称取土壤10g。,在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在,火焰旁,进行,分离不同的微生物采用,不同的稀释度。,原因：,不同微生物在土壤中,含量不同。,目的：,保证获得菌落数在,30300,之间、适于计数的平板。,（三）样品的稀释,特别注意的几个具体操作,25,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？,土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的,。,测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,为获得不同类型的微生物，就,需要按不同的稀释度进行分离,，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,旁栏思考题,微生物,细菌,放线菌,真菌,稀释度,10,4,、10,5,、10,6,10,3,、10,4,、10,5,10,2,、10,3,、10,4,保证获得菌落数在30300的平板进行计数。,稀释度,26,（四）,取样涂布,实验时要对培养皿,作好标记,。注明培养基类型、培养时间、,稀释度,、培养物等。,如果得到了,2个或2个以上,菌落数目在,30300,的平板，则说明稀释操作,比较成功,，并能够进行,菌落的计数,，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要,重新实验,。,特别注意的几个具体操作,27,3.,下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是(),A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板。,B.取10,4,、10,5,、10,6,倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上。,C.将实验组和对照组平板倒置，37 恒温培养2448小时。,D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数。,活学活用,D,28,4.,测定土壤中细菌数量一般选用10,4,、10,5,和10,6,倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量一般选用10,2,、10,3,和10,4,倍稀释，其原因是(),A.细菌个体小，真菌个体大,B.细菌易稀释，真菌不易稀释,C.细菌在土壤中数量比真菌多,D.随机的，没有原因,C,活学活用,29,（五）微生物的培养与观察并计数,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。,选取菌落数目稳定时的记录作为结果,，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要,不同培养温度和培养时间,。,细菌：3037培养12d,放线菌：2528培养57d,霉菌：2528的温度下培养34d。,当菌落,数目稳定,时，选取菌落数在,30300,的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对,3个,平板进行重复计数，然后求出,平均值,，并根据平板所对应的,稀释度,计算出样品中细菌的数目。,特别注意的几个具体操作,30,微生物的培养与观察,关注菌落的,形状,、,大小,、,隆起程度,、,颜色,、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,31,32,注意,研究未知的微生物，一定要注意进行规范的无菌操作，以防被,致病的微生物,感染，实验后，一定要洗手。,（六）鉴定：,筛选后必鉴定,鉴定（鉴别）培养基,：,加入某种指示剂或化学药品，不影响微生物的生存。,1、酚红培养基：,鉴定分解尿素的细菌是否存在,2、伊红美蓝培养基：,鉴定大肠杆菌是否存在,特别注意的几个具体操作,33,1、,酚红培养基,：,鉴定,分解尿素的细菌,。,原理：,脲酶,催化尿素分解成氨培养基碱性,增强,酚红,变红,脲酶阳性,2、,伊红美蓝培养基：,鉴定,大肠杆菌,。,原理：代谢产物与伊红美蓝结合 菌落呈,深紫色并带有金属光泽,。,鉴定（鉴别）培养基的实例：,34,1.,实验设计和操作提示,步骤,实验操作,操作提示,土壤,取样,从酸碱度接近,潮湿的土壤中取样。先铲去表层土_左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,取样用的小铁铲和盛土样的信封都要经过_,制备,培养基,分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和,为唯一氮源的,培养基,牛肉膏蛋白胨培养基可以作为,，用来判断选择培养基是否起到了,作用,3 cm,选择,灭菌,选择,中性,尿素,对照,填一填,35,样,品,的,稀,释,和,涂,布,称取,g土样加到盛有,mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀；,吸取上清液,mL，转移至盛有,mL的无菌水的无菌大试管中，按照上图流程进行样品的稀释；,按照由10,7,10,3,稀释度的顺序分别吸取,mL进行,操作。按照浓度,到,的顺序涂布平板，不必更换移液管,应在,旁称取土样；,由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围,_,倍的稀释液；,实验时要对所用的平板、试管作好,。如培养皿要注明培养基类型、培养时间、,、培养物等,高,稀释度,10,90,1,9,0.1,平板涂布,低,火焰,10,3,10,7,标记,36,培,养,将涂布好的培养皿放在,_,温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录,在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显,_,选择培养基上的数目，才说明选择培养基有,_,作用,3037,选择,多于,37,计,数,当菌落数目,_,时，选取菌落数在_,的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对,_,个平板进行重复计数，然后求出_,，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目,如果得到了_菌落数目符合要求的平板，则说明稀释操作比较成功；,如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明实验不精确，需要_,；,在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目,平均值,重新实验,稳定,30300,3,2个或2个以上,38,三、操作提示,无菌操作,做好标记,制定计划,四、结果分析与评价,（一）如何判断培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落？,对照的培养皿,在培养过程中,没有菌落,生长，说明培养基没有被杂菌污染。,牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目,，说明选择培养基已筛选出一些菌落。,39,（二）如何判断样品的稀释操作是否成功？,如果得到了,2个或2个以上,菌落数目在,30300,的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。,如果学生选取的是同一种土样，,统计的结果应该接近,。如果结果相差太远，需要进一步分析产生差异的原因。,（三）重复组的结果是否一致的判定方法：,四、结果分析与评价,40,课题,小结,稀释涂布平板法,显微镜直接计数法,目的菌株,41,1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）,A.在液体培养基上进行 B.至少接种一种细菌,C.接种一个细菌 D.及时补充消耗的营养物质,2.使用选择培养基的目的是（）,A.培养细菌 B.培养真菌,C.使需要的微生物大量繁殖,D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别,3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是(),A.CO,2,和N,2,B.葡萄糖和NH,3,C.CO,2,和尿素 D.葡萄糖和尿素,课堂训练,A,C,D,42,4.下列说法不正确的是（）,A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶,B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值,C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度,D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。,5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）,A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质,C.青霉素类药物 D.高浓度食盐,B,C,43,（宁夏，15分）,（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑_、_和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、_、,_,等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。,（2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行_（消毒、灭菌）；操作者的双手需要进行清洗和_；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能_。,（3）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的_。,（4）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的_。,（5）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_。,（6）若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过_处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。,温度,酸碱度,易培养,生活周期短,灭菌,消毒,损伤DNA的结构,比例合适,鉴定(或分类),将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间,观察培养基上是否有菌落产生。,灭菌,44,8,45,当堂检测,1.,通常用来作为菌种鉴定的重要依据是(),A.菌落 B.细菌形态,C.细菌体积 D.细菌结构,A,2.,从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，下列实验操作不正确的是(),A.将土壤用无菌水稀释，制备10,3,10,6,土壤稀释液,B.将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上,C.用加入刚果红指示剂的选择培养基筛选分解尿素的细菌,D.从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株,C,46,3.,请选出下列正确的操作步骤(),土壤取样称取10 g土壤，取出加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中吸取0.1 mL土壤溶液进行平板涂布依次稀释至10,1,、10,2,、10,3,、10,4,、10,5,、10,6,、10,7,稀释度,A.B.,C.D.,C,4.,在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是(),A.筛选出能分解尿素的细菌,B.对分离的菌种作进一步鉴定,C.作细菌的营养成分,D.如指示剂变蓝就能准确地认定该菌能分解尿素,B,47,5.,甘蔗是南方地区燃料酒精生产的重要原料。利用甘蔗生产燃料酒精的一般工艺流程为：甘蔗榨汁(蔗糖)酵母菌发酵蒸馏成品(燃料酒精)。,(1)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：,步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。,步骤2：制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意,_,和,，加琼脂后灭菌，制成固体平板。,步骤3：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板。,步骤4：根据,_,，筛选出突变菌。,添加高,浓度蔗糖(葡萄糖),调低pH,是否能在选择培养基上生长,48,(2),上述步骤2、3和4的依据分别是_,_,。,5.,甘蔗是南方地区燃料酒精生产的重要原料。利用甘蔗生产燃料酒精的一般工艺流程为：甘蔗榨汁(蔗糖)酵母菌发酵蒸馏成品(燃料酒精)。,(1)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：,步骤2：制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意,_,和,，加琼脂后灭菌，制成固体平板。,步骤3：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板。,步骤4：根据,_,，筛选出突变菌。,添加高,浓度蔗糖(葡萄糖),调低pH,是否能在选择培养基上生长,获得单菌落；能生长的菌落具有耐高糖和耐酸的特性,提供高糖和酸性的筛选环境；,49,课后练习,2.提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括,分解尿素的微生物,。由于瘤胃中的微生物多为,厌氧菌,，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备,选择培养基,外，还应参照,厌氧菌的培养,方法进行实验设计。,50,大肠杆菌呈 黑色中心,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征,伊红美蓝培养基,是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的,代谢产物与伊红美蓝结合,，使菌落呈,深紫色并带有金属光泽,，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。,例如：鉴别大肠杆菌培养基,51,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,52,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,53,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,54,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,55,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,56,归纳提炼,1.,选择培养基,(1)选择培养基的含义：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长。目的是从众多微生物中分离出所需要的微生物。,(2)常见的选择培养基,加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。,加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。,无氮源培养基可以分离固氮微生物。,57,石油是唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物。,将培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。,2.用稀释涂布平板法对微生物进行计数时的注意事项,(1)为了保证结果准确，一般设置35个平板，选择菌落数在30300的平板进行计数，并取其平均值。,(2)统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。,58,