抗体纯化.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,抗体的纯化,1,一 纯化目的,从血清中提取特异性结合的抗体,2,二 纯化原理,常用盐析法、凝胶柱层析、离子交,换剂层析以及免疫亲和层析等技术对血,清抗体进行分离纯化。,3,盐析法原理,水膜与同性电荷的排斥作用是蛋白质胶体稳定的基础，在蛋白质胶体溶液中加入一定量的（NH,4,）,2,SO,4,或Na,2,SO,4,盐类，使溶液中大部分自由水分子转变为离子水化分子，降低蛋白质极性基团与水分子的相互作用，破坏蛋白质水膜，蛋白质溶解度也随之降低。蛋白质由于分子质量和携带的电荷不同，可在不同浓度的高盐溶液内分级析出。33%（NH,4,）,2,SO,4,为沉淀IgG的最适饱和度。,4,离子交换层析原理,利用蛋白质的酸碱性质，使蛋白质混合物与离子交换纤维素的酸性基或碱性基相结合。由于盐类的存在可以降低离子交换剂的离子基团和蛋白质的相反电荷基团之间的静电相互吸引，通过改变溶液中盐类离子强度和PH可以将蛋白质分离。层析血清IgG的常用纤维素为DEAE-32。,5,免疫亲合层析原理,把具有识别能力的配体L以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M上，制成亲和吸附剂M-L，或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此，当把固相载体装入小层析柱后，让欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可以借助静电引,6,力、范德华力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异性吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来；然后恰当的改变起始缓冲液的PH值或增强离子强度或加入抑制剂等因子，即可以把物质S从固相载体上解离下来，通过这一操作程序就可以把有效成分与杂质分离开来。,7,8,基质的选择,理想的基质应满足下面的要求：,1极低的非特异性吸附性,2.高度的亲水性。亲和吸附剂要易与水溶液中的生命大分子物资接近；,3.较好的理化稳定性。当配体固化和各种因素（如PH、离子强度、温度和变性剂等）变化时，基质很少甚至不受影响；,9,4.大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合；,5.适当的多孔性。具体要求须根据分离物的性质而定。,一般的亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、胶联琼脂糖以及多孔玻璃珠。目前用的最多的是琼脂糖珠。,10,配体的选择,1.配体要与纯化的物质有较强的亲和力,2.配体要具有与基质共价结合的基团,根据所选的配体不同，我们用免疫亲和层析法纯化抗体的方法可分为：,a.蛋白A或蛋白G柱纯化,蛋白A或蛋白G是细胞壁蛋白，它们能结合抗体Fc段.这一结合非常牢固，但亲和力对PH 的变化敏感，抗体/蛋白A或蛋白G的亲和力随PH值的降低而急剧降低。由于它们对不同类型抗体的结合能力存在差异，对它们的选择如下图,11,b.抗原柱纯化,12,三 纯化步骤,3.1试剂：,3.1.1couping buffer：0.1MNaCO3 0.5MNaCl Total 1L(PH8.3),3.1.2PBS 10 mM Na2HPO4 3.58g,1.8 mM NaH2PO4 0.28g,140 mM NaCl 8g,Total 1L PH7.4,3.1.3 1mMHCl(PH 2-3),3.1.4,封闭液,：1M Tris（PH8.0）,3.1.5,中和液,：饱和磷酸盐溶液,3.1.6 CBB 溶液,3.1.7 0.01M Tris(PH7.5),3.1.8 洗脱液：PH2.5 HCl+150Mm NaCl,13,3.2 步骤,3.2.1抗原透析（仅用于融合蛋白）,3.2.1.1 准备好透析夹,并在上面贴上标签,3.2.1.2 剪取适当长的透析袋（1cm透析袋约可容纳3ml的溶液）,PBS洗三次3次,3.2.1.3 透析夹夹好透析膜的一端,加入抗原,夹好另一端,3.2.1.4 配制新鲜的透析液,并将透析膜置于其中,4 6小时或者过夜,重复三次;(注意:透析中应经常观察,一是防止透析袋中的蛋白发生沉淀,二是防止透析夹上的标签脱落),14,3.2.2连接,3.2.2.1 准备好 1mMol/L HCl，并放入4预冷,3.2.2.2 计算所需的CNBr-activated Sepharose4B的量（1克冻干的粉末可以活化成3.5ml的beads，1mlbeads吸附5-10mg蛋白）；,3.2.2.3 将称量好的beads放入预冷的HCl中活化，在4放置15min,3.2.2.4 剪好滤纸，装好抽滤装置，先用预冷的HCl冲洗抽滤装置,3.2.2.5 将beads加入抽滤装置中，1mlbeads用200ml HCl 抽滤,15,3.2.2.6 将抽滤后beads放在一干净的PE 手套上，与透析好的抗原一起转移到15ml离心管中，封口膜封口，孵育，室温2小时或4过夜,3.2.2.7 将结合了抗原的beads转移到纯化管中，加入couping Buffer15ml冲洗,3.2.2.8 加入封闭液3ml，孵育，室温2小时或4过夜,3.2.2.9 PBS冲洗3次,16,3.2.3 纯化,3.2.3.1 将连接抗原的beads和血清一起孵育，室温2小时或4过夜,3.2.3.2 让血清流出纯化管，收集,3.2.3.3 用10ml PBS冲洗beads,3.2.3.4 在EP管中事先加入50ul中和液,3.2.3.5 加入洗脱液，每次1ml，分管收集,3.2.3.6 同时用CBB溶液检测收集的抗体浓度，100ulCBB溶液加入3.3ul收集液,17,3.2.3.7 将浓度高的收集液集中，于4暂时保存,3.2.3.8 加入0.01M Tris(PH7.5)15ml,3.2.3.9 加入15ml PBS冲洗,3.2.3.10 加入2ml含0.02%叠氮钠的PBS储存beads，4,3.3,抗体长期保存条件,:50%甘油+0.1%叠氮钠,18,