炭疽检验技术.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,炭疽检验技术,炭疽检验技术,第1页,炭疽是由炭疽杆菌引发人兽共患急性、热性、败血性传染病。其病理改变特点是脾脏显著肿大，皮下及浆膜下结缔组织出血浸润，血液凝固不良，呈煤焦油样。人感染后多表现为皮肤炭疽、肺炭疽及肠炭疽，偶有伴发败血症。,炭疽,（,Anthrax,）,炭疽检验技术,第2页,发病、,死亡,污染环境,形成芽胞,经口,食入,食草动物,经过直接接触、,消化道、呼吸道等路径,感染人类,食肉动物,偶然感染,炭疽检验技术,第3页,革兰氏染色阳性；,长而直大杆菌，菌体两端平直；,大小为,1.0,1.5um3,5um,，致病菌中最大；,无鞭毛，不能运动。,一、病原,炭疽杆菌（,Bacillus anthracis,）,炭疽检验技术,第4页,荚膜染色,在碳酸盐培养基中、厌氧环境下生成荚膜。,一、病原,炭疽杆菌（,Bacillus anthracis,）,炭疽杆菌在病人、病畜体内多散在或呈,2,3,个短链排列，有荚膜（,红色,）,炭疽检验技术,第5页,在活炭疽病畜体或死亡后未经解剖尸体内，不形成芽胞。一旦体内炭疽杆菌,暴露于空气,中，接触了游离氧，在,一定温度,下,(12-42),就会,形成芽胞,。芽胞呈卵圆形或圆形，位于菌体中央或稍偏向一端。,一、病原,炭疽杆菌（,Bacillus anthracis,）,炭疽检验技术,第6页,A,：炭疽芽孢薄片（透射电镜）有致密胞膜,B,：炭疽芽孢（扫描电镜）收缩成椭圆形,C,：炭疽繁殖体薄片（透射电镜）,炭疽检验技术,第7页,炭疽杆菌为兼性需氧菌，在,12,44,都能生长，最适生长温度为,37,。最适,pH,为,7.3,7.6,。,在普通琼脂平皿培养基上生长成不透明、灰白色、扁平、表面粗糙菌落，边缘不整齐，能形成几个或数十个菌体相连长链，低倍显微镜观察呈,卷发状,。在血液琼脂平皿培养基上，生长出湿润粘稠菌落，菌落周围,不溶血,。,二、培养特征,炭疽检验技术,第8页,光镜下炭疽杆菌菌落边缘呈卷发状,炭疽检验技术,第9页,在血液琼脂平皿培养基上不溶血或微溶血,炭疽检验技术,第10页,三、致病性与免疫性,致病物质,:,主要有二种,荚膜,:,由质粒编码,含有抗吞噬作用,炭疽毒素,:,由质粒编码（致死主要原因）,保护性抗原（,protective antigen,，,PA,）,水肿因子 （,edema factor,，,EF,）,致死因子,(lethal factor,，,LF),炭疽检验技术,第11页,四、抵抗力,芽胞抵抗力强,煮沸,40min,或干热,140C 3h,灭活；,在干燥土壤或皮毛中能存活数年至,20,年；,对化学消毒剂抵抗力强,(5%,石炭酸,5d,杀死）；,对碘及氧化剂较敏感；,繁殖体抵抗力弱,对青霉素、红霉素、氯霉素敏感,炭疽检验技术,第12页,炭疽病原学检验,炭疽血清学检验,五、炭疽试验室检验,炭疽检验技术,第13页,炭疽病原学检验,标本采集和样品处理,细菌培养,涂片、革兰染色、荚膜染色、光镜检验,Ascoli,试验,动力检验,噬菌体裂解和青霉素敏感性试验,串珠试验,生化试验,炭疽,PCR,基因检测,五、炭疽试验室检验,炭疽检验技术,第14页,炭疽血清学检验,标本采集和样品处理,血清中抗炭疽芽胞和毒素,IgG,水平检测,（酶联免疫吸附试验,ELISA,）,血清中抗炭疽荚膜抗体胶体金检测,五、炭疽试验室检验,炭疽检验技术,第15页,人间传染病原微生物名目,序号,病原菌名称,危害程度分类,试验活动所需生物安全试验室等级,学名,汉字名,大量活菌操作,动物感染试验,样本检测,非感染性材料试验,1,Bacillus anthracis,炭疽芽孢杆菌,第二类,BSL-3,ABSL-3,BSL-2,BSL-1,2,Brucella spp,布鲁氏菌属,第二类,BSL-3,ABSL-3,BSL-2,BSL-1,3,Burkholderia mallei,鼻疽伯克菌,第二类,BSL-3,ABSL-3,BSL-2,BSL-1,4,Coxiella burnetii,伯氏考克斯体,第二类,BSL-3,ABSL-3,BSL-2,BSL-1,大量活菌操作：试验操作包括“大量”病原菌制备，或易产生气溶胶试验操作（如病原菌离心、冻干等）。,动物感染试验：特指以活菌感染动物试验。,样本检测：包含样本病原菌分离纯化、药品敏感性试验、生化判定、免疫学试验、,PCR,核酸提取、涂片、显微观察等初步检测活动。,非感染性材料试验：如不含致病性活菌材料分子生物学、免疫学等试验。,炭疽检验技术,第16页,炭疽病原检验程序,标本,处理（方法依据标本情况选择）,直接涂片、,革兰染色、,荚膜染色、,光镜检验,接种培养,（可用选择性培养基、血培养基）,37,，,1648 h,Ascoli,试验,基因检测,可疑菌落（形态）,初检,培养性判定试验,深入判定,涂片、革兰染色、荚膜染色、,光镜检验,动力检验,液体培养,噬菌体裂解和青霉素敏感性试验,产荚膜培养及光镜检验,串珠试验,生化试验,基因检测,酶免疫法测外毒素,动物毒性测定,炭疽检验技术,第17页,采取标本时必须遵照两条标准,1,、尽可能在抗生素治疗前采取标本；,2,、除必要时并在具备条件试验室内，不得用解剖方式获取标本，所需血液与组织标本，均应以穿刺方式取得。,（一）炭疽病原学检验,标本采集和样品处理,炭疽检验技术,第18页,1,、血液标本,全部疑似病例和病畜，都应采取血液标本,5-10ml,，标本量最少应满足以下检验需要：,涂片进行显微镜检验；,接种培养基进行细菌分离培养；,分离血清检验抗体；,常规血液检验。,荧光定量,PCR,检测,2,、皮肤溃疡标本,在皮肤炭疽病人溃疡边缘用棉拭子擦拭，沾取分泌物。,（一）炭疽病原学检验,标本采集和样品处理,炭疽检验技术,第19页,3,、粪便与呕吐物标本,表现消化道症状可疑病人搜集粪便或呕吐物标本，尤其注意选取其中混有,血液,个别，置无菌容器中。,4,、痰与咳碟标本,表现为呼吸道症状可疑病人应搜集其痰液标本，无痰液者，应取供细菌分离培养用培养基，打开平皿盖置病人口鼻,10cm,处；令病人对平皿咳嗽，然后快速盖上平皿。,（一）炭疽病原学检验,标本采集和样品处理,炭疽检验技术,第20页,5,、脑脊液标本,表现为脑膜刺激症状病人，腰椎穿刺获取脑脊液。,6,、尸体标本,食草动物死于炭疽时，通常会从口、鼻、肛门等腔道开口流出血液这种血液应是首先采取标本。假如血液已渗透土壤，则应搜集混有血液土壤作为标本。没有血液流出，或已不可能获取血液标本时，可经过穿刺心脏取得血液或穿刺肝脏等实质性脏器取得组织标本。,（一）炭疽病原学检验,标本采集和样品处理,炭疽检验技术,第21页,7,、肉类标本,假如怀疑罹患炭疽牲畜已被宰杀，或对商品肉类进行常规检验时，可剪取小块肉类标本。如有可能，尤其应剪取肝脏、脾脏等富含血以及含有淋巴组织标本。,8,、毛皮或其它可疑污染物品标本,剪取小块毛皮或其它可疑物品，剪碎置无菌试管内，加适量无菌生理盐水浸泡。,（一）炭疽病原学检验,标本采集和样品处理,炭疽检验技术,第22页,9,、水标本,检验水体污染时用广口瓶搜集水样。,10,、土壤标本,在牲畜死亡或宰杀地点，应取土壤标本以供检验。普通要采集表层土壤（,10cm,内），每份,150g,左右。,（一）炭疽病原学检验,标本采集和样品处理,炭疽检验技术,第23页,全部来自病人、病畜、尸体标本都应首先进行直接涂片镜检。,步骤：,涂片、革兰染色及荚膜染色、显微镜检验,镜检：取末稍血液或其它材料制成涂片后，染色镜检，发觉有,多量,单在、成对或,2,4,个菌体相连短链排列、竹节状有荚膜粗大杆菌，即可确诊。,（二）炭疽病原学检验,显微镜检验,炭疽检验技术,第24页,革兰染色,（二）炭疽病原学检验,显微镜检验,炭疽检验技术,第25页,荚膜染色,（二）炭疽病原学检验,显微镜检验,炭疽检验技术,第26页,采集到标本均应进行细菌分离培养。,培养基选取,血琼脂平板、营养琼脂平板,和选择性平板。,（三）炭疽病原学检验,细菌分离培养,炭疽检验技术,第27页,标本处理：,无菌标本，如血液或脑脊液，直接涂布上述两种平板，每平板,0.1ml,，组织标本应先以无菌剪刀剪开一断面，在培养基表面压印，然后以白金耳涂开。,污染或陈旧标本，均应首先制成悬液。依据标本中含菌量多少，可将悬液适当稀释，或经自然沉淀除去粗大沉淀物后，再,10000rpm,离心,1,分钟，取富集沉淀物。将所得悬液沸水浴,15min,，冷却后涂布上述两种平板，每平板,0.1ml,。,（三）炭疽病原学检验,细菌分离培养,炭疽检验技术,第28页,以上平皿在,37,孵育过夜或,24,小时后，观察培养情况。,粗糙不发光，比较扁平，有点儿象蜡样杆菌菌落但较小，卷发状。有,菌体形态不规则,，,有彗星状拖尾，,白或灰白色。,（三）炭疽病原学检验,细菌分离培养,炭疽检验技术,第29页,在血平皿上为白色菌落，较粘，不溶血或微溶血。,（三）炭疽病原学检验,细菌分离培养,炭疽检验技术,第30页,在静止液体培养基中生长在上层和底部，培养基透明，拿起则呈丝絮状下垂，摇之均匀混浊，无菌膜和壁环。,1,、肉汤生长,（四）炭疽病原学检验,判定试验,炭疽检验技术,第31页,诊疗炭疽简便而快速方法，其优点是培养失效时，仍可用于诊疗，因而适宜于腐败病料及动物皮张或风干、淹浸过肉品检验。但此法,缺乏高度特异性,，因为炭疽杆菌耐热抗原在其它腐生芽胞杆菌也共有。,新鲜、陈旧和外环境标本都可采样,20-50g,，加水,5-10,倍，煮沸,10,分钟，用双层滤纸过滤后制成,可溶性热沉淀抗原,，用于热沉淀反应（,Ascoli,试验。,2,、,Ascoli,试验,（四）炭疽病原学检验,判定试验,炭疽检验技术,第32页,取一玻璃沉淀管（直径,2-4 mm,，高,20-40 mm,），将,0.3 ml,炭疽菌沉淀血清加于小玻璃管底部，再缓缓加入采集处理可溶性热沉淀抗原约,0.3ml,于血清上层，,注意勿使液面混合,。置,37 5 min,，于两液面间出现白色沉淀环为阳性。,本试验应有炭疽菌诊疗抗原作阳性对照。,炭疽菌沉淀血清,处理可溶性热沉淀抗原,白色沉淀环,（四）炭疽病原学检验,判定试验,2,、,Ascoli,试验,炭疽检验技术,第33页,在盖玻片周围涂凡士林，将待检菌液体培养物或固体培养物用生理盐水制成均匀悬液滴于中央，再将凹玻片盖于其上。快速翻过来使盖玻片在上，菌悬液悬成滴。置高倍镜下观察，细菌不应有运动。,3,、动力试验,（四）炭疽病原学检验,判定试验,炭疽检验技术,第34页,4,、,噬菌体裂解和青霉素敏感性,将挑取可疑菌落密集划线接种于平板上，在划线区内一处滴一诊疗用炭疽噬菌体，另一处贴一片青霉素纸片。,37孵育,8,24h,后，在滴噬菌体处有透明噬菌体斑，青霉素纸片周围有显著抑菌环，廉价可断定接种物为炭疽芽胞杆菌。,（四）炭疽病原学检验,判定试验,炭疽检验技术,第35页,4,、,噬菌体裂解和青霉素敏感性,（四）炭疽病原学检验,判定试验,炭疽检验技术,第36页,制备有牛肉消化液琼脂培养基载玻片，涂种待检菌，在一端加青霉素纸片或纸条。置平皿中于,37,培养,4,6,小时后，在低倍镜下观察。在有菌生长和抑菌区临界限处，应有显著经典串珠形态。,5,、串珠试验,串珠试验时炭疽杆菌形态：串珠状或长链状,（四）炭疽病原学检验,判定试验,炭疽检验技术,第37页,葡萄糖,麦芽糖,蔗糖,乳糖,甘露醇,水杨素,MRVP,石蕊牛乳,+,+,+,产酸，液化迟缓,产酸不产气,不产生靛基质和,H,2,S,6,、生化试验,API 50CH/E,判定条能够进行炭疽生化判定,（四）炭疽病原学检验,判定试验,炭疽检验技术,第38页,待测模板制备：,模板制备可直接从标本样品，也可从培养物制。标本将炭疽杆菌接种于固体培养基平板上，,37,培养,18h,，取培养物悬浮于,1ml,生理盐水，离心，弃上清，沉淀用,ph7.8TE,溶液洗起悬浮，于沸水浴中煮,15min,。离心，,上清用,0.22um,滤器除菌过滤,。滤液即为模板，可置,4,备用于,PCR,扩增。,（五）炭疽病原学检验,PCR,判定试验,炭疽检验技术,第39页,cap,外,F,：,CCTGGTTGTTCTTTTCGTTGC,cap,外,R,：,CGGATTGTATATGGAGTGGG,产物大：,1242bp,rpoB,普,1F,：,GTACGCCAATCGATATCATG,rpoB,普,1R,：,GATCATCGTCATCTTCCGTA,产物大小：,618bp,pagA,普,F:ATTTGCGGTAACACTTCACT,pagA,普,R:AGACCGTGACAATGATGGAA,产物大小：,923bp,引物序列：,（五）炭疽病原学检验,PCR,判定试验,炭疽检验技术,第40页,反应体系,(50,l,),10,反应缓冲液,5l,4dNTP,混合物（每种2.5mM,）,4l,引物（上游）,1l,引物（下游）,1l,待测模板,1l,无菌去离子水,37l,Taq DNA,聚合酶,1l,反应条件：,预变性,95 5min,；,然后,95 1 min,，,55 1 min,，,72 1 min,，,30,个循环；,最终,72 5 min,。,（五）炭疽病原学检验,PCR,判定试验,炭疽检验技术,第41页,标本采集和样品处理,血清中抗炭疽芽胞和毒素,IgG,水平检测,（酶联免疫吸附试验,ELISA,）,血清中抗炭疽荚膜抗体胶体金检测,炭疽血清学检验,炭疽检验技术,第42页,依据血清学检验结果能够对病人做出追溯诊疗，因为诊疗必须由双份血清做出，需要尤其强调急性期血清采取。,首份血清应在检视病人时采取，通常应一次采取血液标本供涂片镜检，细菌分离培养，血清学检验及常规血液检验使用。血清分离后置,4,保留，待取得恢复期血清后，一同进行抗体检验。,恢复期血清应在发病后,15,日左右采取。,（一）炭疽血清学检验,标本采集和样品处理,炭疽检验技术,第43页,（二）炭疽血清学检验,抗炭疽芽胞和毒素,IgG,水平,ELISA,测定,炭疽检验技术,第44页,抗炭疽芽胞和毒素,IgG,水平,ELISA,测定程序,包被抗原,：,所用各孔加入检测用炭疽标准芽胞抗原液或检测用炭疽毒素抗原液100 l，酶标板贴上封口膜，置4过夜。次日，甩干孔内溶液，每孔加洗涤缓冲液100 l，甩干，重复洗涤3次，每次3 min。,待检血清反应,：,每种待测血清使用两行，以增加测定结果可分析性。,两行112孔各加生理氯化钠溶液100 l。在第1孔加待测血清100 l，从第1孔以倍比稀释法向后至第12孔进行稀释混匀。酶标板贴上封口膜，置37 60 min。甩干孔内溶液，每孔加洗涤缓冲液100 l，甩干，重复洗涤3次，每次3 min。(同时做空白、正常血清孔对照),酶标抗体反应,：,于各反应孔中加入新鲜稀释工作浓度辣根过氧化物酶标识羊（兔）抗人IgG或辣根过氧化物酶标识SPA 100 l，酶标板贴上封口膜，置37 60 min。甩干孔内溶液，每孔加洗涤缓冲液100 l，甩干，重复洗涤3次，每次3 min。,显色反应,：,于各反应孔中加入显色底物,A,、,B,溶液,50 l,，酶标板贴上封口膜，置暗处,20 min,。,终止显色,：,于各反应孔中加入显色终止液,100 l,。,OD,值读取和结果判定,：,在酶标仪上，于450 nm波优点，被检测孔OD值达阴性血清对照孔OD值2.1倍时，可判断为阳性。,也可用目测判读，被检测孔显示与阴性对照孔含有显著区分黄褐色时，可判为阳性。,炭疽检验技术,第45页,（二）炭疽血清学检验,抗炭疽芽胞和毒素,IgG,水平,ELISA,测定,注意事项：,标本采集时应尽可能,防止溶血,，因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质,以,HRP,为标识ELISA,测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色；菌体中可能含有内源性,HRP,长菌标本,一样道理易产生,假阳性,。,抗凝不完全标本因纤维蛋白原干扰而造成假阳性，提议尽可能,不用抗凝血,尤其是用肝素抗凝剂。,标本在冰箱中保留时间过长易造成血清,IgG,聚合，普通血清置,4,冰箱,5,天,内完成测试。如需保留,一周以上,则要,-20,冷冻,保留，融解时应上下颠倒充分混匀，同时防止气泡。,炭疽检验技术,第46页,（三）炭疽血清学检验,血清中抗炭疽荚膜抗体胶体金检测,检测对象为抗荚膜抗体，,疫苗株不带有荚膜，所以能够判别免疫接种与感染。,能够检测循环总抗体，即,IgG,、,IgM,均可检出。,检测方法：将人活动物血清标本,1,：,40,稀释后，取,150ul,加入加样孔，,2,分钟后开始观察，,15,分钟终止观察。,阴性,阳性,炭疽检验技术,第47页,