免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,引言,：,1842,年,BeNNeftt,首先提出了“组织学”，同时,virchow,作了大量正常和病理组织显微镜研究，于,1856,年发表了“细胞病理学”。百余年来组织病理学进展很快，但在应用和解释形态学标按时仍有困难，单靠组织切片检验有时并不能作出全方面诊疗，随之发展了特殊染色和各种组化技术，为病理诊疗提供了新参考依据。,1941,年由,cooN,等建立荧光抗体在组织切片中检测细胞抗原技术，首次提供了一个依据细胞抗原及细胞产物来识别细胞伎俩，这种伎俩在病理一些领域，尤其是肾脏病、皮肤病研究中取得了非常大成功。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第1页,但在外科病理学中并未得到推广，主要是因为该方法需要新鲜组织作冰冻切片，并只能取得较少形态学特征，这对于传统依据细胞形态学特征，有时甚至是极细微表现来识别细胞和诊疗肿瘤外科病理学家来说无疑是一大障碍。尽管荧光抗体技术并未在肿瘤研究中得到广泛应用，但因为其简便而快速特点，在肾小球肾炎、皮肤病研究中仍发挥着主要作用。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第2页,1966,年,NakaNe,和,Averameas,等建立了免疫酶标技术，,1970,年,seerNberger,等人发展了一个过氧化物酶抗过氧化物酶,(PAP),技术1975,年,Kohler,和,MilsteiN,建立了杂交瘤制备单克隆抗体技术，这些对于外科病理发展是一个重大技术里程碑。伴随辣根过氧化物酶代替荧光素异硫氰酸盐，作为初级抗体标识物，一个全新信号分子得到了应用，在辣根过氧化物酶中加入显色底物进行染色，产生一个能被普遍光镜所观察稳定显色反应。酶免疫组化法对于病理学家诊疗肿瘤、对其分类、判断预后产生了巨大影响，同时也扩展了人们对于各种疾病与肿瘤形成过程认识，提升了病理诊疗与研究水平。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第3页,一、,免疫组化技术,利用能与特异性抗体结合酶，在酶,-,抗体,-,抗原反应位点上诱导经过底物或显色剂而完成变色反应。辣根过氧化物酶是免疫酶学原型，其它酶系统如葡萄糖氧化酶，碱性磷酸酶也被成功应用。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第4页,酶桥法：,利用酶联抗体将酶与组织切片中抗原相结合，经过与适当底物反应（通常是,H,2,O,2,）以及二氨基联苯胺,(diamiNobeNzidiNe DAB),显色剂，产生一个不溶性棕色反应产物。该法已被深入改进发展为更敏感多级桥联法，后者利于增加在抗原部位反应产物沉积。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第5页,PAP,法是过氧化物酶,-,抗过氧化物酶,(PAP),复合物，包含辣根过氧化物酶抗体，及辣根过氧化物酶抗原组成可溶性复合物为五环状结构，,3,个分子辣根过氧化物酶和二个抗体分子组成，极为稳定，比免疫荧光法敏感,100-1000,倍，比酶桥法敏感,20,倍，其原理是特异性初级抗体（一抗）,Fab,段与组织抗原结合，二抗（桥抗）在一抗与,PAP,复合物之间形成份子桥联，此时一抗与,PAP,中免疫球蛋必须是同一个属，以使得衍生自其它种属二抗，对一抗分子,PAP,中,FC,段及稳定成份都含有特异性。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第6页,因为免疫酶学技术普遍使用辣根过氧化物酶，所以组织切片中内源性过氧化物酶一开始就必须用,H,2,O,2,或,H,2,O,2,和甲醇组成混合物加以灭活，并经过与桥抗同一个属起源非免疫稀释血清阻断非特异性结合，足够桥抗使全部游离抗原结合位点都能与,PAP,复合物连接，并在加入,PAP,可溶性复合物到组织切片中反应之前洗去未结合桥抗，最终使,PAP,复合物与底物及显色剂反应，,以产生能被普通光镜所见到不溶性棕色产物，以此识别组织切片中抗原所在位置。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第7页,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第8页,免疫酶学技术还包含碱性磷酸酶,-,抗碱性磷酸酶,(APA-AP),系统,2,及葡萄糖氧化酶抗葡萄糖氧化酶（,GAG),系统等，这些技术与,PAP,技术相同，只不过是将碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶代替辣根过氧化物酶而已，据称这两种技术能够降低背景染色干扰，因为对应内源性酶在组织中分布有限，尤其是,APA-AP,技术更适合用于血液标本染色。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第9页,生物素是一个低分子量维生素，能够与一抗共价结合。亲合素是一个从卵白素中提取含有,4,个生物素结合位点糖蛋白，这一特征能使之成为多级免疫酶学系统各成份之间桥接物。,1981,年,Hsu,等人建立了,卵白素,-,生物素,-,过氧化物酶,(AvidiN BiotiN-peroxidase Complex ABC),系统,。该方法是经过生物素相关次级抗体将一抗连接到卵白素,-,生物素,-,过氧化物酶复合物上，结果产生复合物是一个点阵样三维结构复合物，有利于将多个辣根过氧化物酶分子结合于切片中一个抗原所在位点上，所以比,PAP,法更灵敏，约比,PAP,法敏感,8-40,倍，特异性强、非特异性背景着色低、方法简便、应用广。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第10页,ABC,系统经过将链球菌抗生物素蛋白代替抗生物素蛋白而得到深入改进，称为,链球菌抗生物素蛋白,-,生物素系统,(StreptavidiN biotiN system SAB),。链球菌抗生物素蛋白在生理,PH,环境中为电中性，而不产生非特异性结合，而抗生物素蛋白在生理,PH,环境中带正电荷。应用抗生物素蛋白,-,生物素法时，内源性生物素能与抗生物素蛋白,-,过氧化物酶复合物直接结合而产生非特异性或称假阳性染色，防止方法可先经过切片与游离抗生物素蛋白反应以去除游离生物素。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第11页,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第12页,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第13页,葡萄球菌,A,蛋白,(Staphylococcal proteiN A SPA),是金黄色葡萄球菌细胞壁上一个蛋白成份，,单链多肽，分子量为,4,，,SPA,最大特点是能与不一样种属血清中免疫球蛋白分子稳定,FC,段结合，另外还能与其它物质如荧光素、过氧化物酶、铁蛋白、胶体金等结合，并不影响其生物活性，所以被用来发展为一个简便而快速免疫过氧化物酶法，即用,SPA,代替,PAP,技术中次级抗体，因,SPA,可与各种动物抗血清反应，而不需因不一样种动物而制备对应第二抗体。,SPA,能够结合大多数,IgG,分子，能够充当第一抗体和衍生自不一样种属抗过氧化物酶抗体桥接物即,SPA-,过氧化物酶联法。同时因为,SPA,与,FC,段高亲和力能够降低非特异性背景染色。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第14页,金属离子和金属蛋白复合物如铁蛋白、金和汞可作为免疫组化反应中标识物，如,免疫金银法,(ImmuNogold silver techNique IGST),。其基本原理是用特异性抗体与抗原反应，随即用金标识间接抗体或,SPA,蛋白，再与特异性抗体结合，用乳酸银处理，使银颗粒沉积在金颗粒上，还原银反应而显示出黑褐色。适合用于石蜡切片，冰冻切片，培养细胞，细胞涂片和树脂包埋电镜切片，该法敏感性高，可检测组织中微量抗原，定位准确，无扩散现象，背景清楚，对比度好，方法简便。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第15页,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第16页,美国抗体企业新近又推出,“二步法”,系统，去除了与内源性生物素非特异性结合，含有灵敏度高，无背景，步骤少，节约时间等很多优点，其原理是经过一个葡聚糖分子，将多个抗小鼠或抗兔二抗同多个辣根过氧化物酶,(HRP),或碱性磷酸酶,(AP),聚合在一起。因为葡聚糖分子较大，其每个骨架能够结合多达,100,个酶分子和,20,个抗体分子，所以大大提升了检测灵敏度，,又因为二抗和酶合二为一，其测定过程最少比,SBA/ABC,法少一个步骤。另外无需阻断内源性生物素，所以血清封闭这一步能够省去。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第17页,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第18页,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第19页,原位杂交也称为“杂交组织化学”,(HydridizatioN Histochmistry),是在单个细胞水平上提供了形态学定位特异性,DNA,或,RNA,次序，,DNA,二条链之间以碱基氢键相连，而四种碱基均按严格互补规律结合成对,(T,或,U-A,C-G),，,DNA,经变性处理碱基间氢键发生断裂，双链,DNA,可解离成单链，终止变性处理后，,DNA,可恢复双链结构，因而利用标识已知核苷酸序列,DNA,片断作为探针，按碱基配正确互补标准去检测组织切片中,DNA,或,RNA,。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第20页,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第21页,二、,显色剂,在各种免疫组化显色剂中，,3.3-,二氨基联苯胺,(DAB),是当前用得最多，它棕色反应产物清楚可见，且不溶于酒精，所以适合用于各种抗体染色及固定介质中，但,DAB,含有致癌性。,3-,氨基,-9-,乙基卡巴唑,(AEC),为红色终产物，溶于酒精，使用该显色剂时需要一个特殊含水固定介质，其反应产物不稳定，在贮存过程中密度逐步降低。与,DAB,一样,AEC,也含有致癌性,8,，所以没有足够理由将其作为,DAB,替换物。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第22页,其它显色剂如,4-,氯,-1-,萘酚为兰色终产物，溶于酒精、盐酸对苯二胺,/,焦性儿萘酚，形成兰黑色终末产物，不溶于酒精。四甲基联苯胺、,-,萘酚和同香草醛酸，它们作用是在有,H,2,O,2,存在情况下，由氢化物酶介导其产生氧化诱导反应，产生一个沉积于组织中抗体,-酶复合物位置上可见氧化产物。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第23页,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第24页,三、,试剂,免疫组化质量好坏主要原因之一是所应用第一抗体质量，单克隆抗体有很强特异性，不一样批号之间差异不大，因为它们主要是针反抗原表位，而不是整个抗原，所以单克隆抗体较常规多克隆抗体敏感性低。实际上有些单克隆抗体，尤其是作用于细胞表面抗原，可能只与低温，恒温切片中未固定细胞反应，所以这种单抗应用受到限制。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第25页,第一抗体有时与商标说明并不相同。所以每个试验室须将新购抗体进行测试，普通可在多组织块,(,即由,20-30,种不一样瘤组织组成复合物）中进行测试。,试剂最正确浓度确实定受到固定方法、时间、组织处理过程影响，最正确浓度在不一样试验室是不一样，最适当稀释度是以得到最大强度特异性染色和最弱背景染色为标准。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第26页,在诊疗性免疫组化中质量控制是个主要问题。美国生物染色委员会成立了一个教授小组，以负责检测商品抗体程序，这是质量控制确保伎俩，并使从属商品以及商品试剂信息标准化，美国食品及药品管理局（,FDA),经过美国病理学会同意出台一项政策，列出了,61,种在一些严重疾病诊疗和,/,或监测中充分标准单克隆抗体，并要求制造商自政策发表之日起,30个月内向,FDA,提交适当产品使用申请，在此期间产品虽被允许用于医学目标在市场销售，但制造商们必须在产品上标明“未经法律同意，暂时供给以满足主要医学目标”。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第27页,另外，制造商及进口商将负责确保通知全部试验室中医生及相关人员。制造商们必须确保在,30,个月内给出产品安全性及效能数据,不然将从市场上消失。,FDA,这些限制是针对外科病理学检验中所应用试剂，但其含意显著延伸到免疫组化中应用试剂。关于是否有必要区分应用于免疫组化，流式细胞仪，以及外科病理检验中抗体，当同种抗体应用于不一样目标时其抗体标准及范围讨论仍在继续，免疫组化方法标准化，如组织准备，染色时段等，使各试验室之间标准化与进行比较是十分困难，自动化染色便能很好处理这个问题，自动化染色可使各试验室间标准统一。不过免疫组化方法中主要一点是组织固定与处理方法在各试验室间区分甚大，以致于即使实现自动化也极难到达标准统一，自动化将实现试验室内部标准化，使定量技术如密度分析得以实现。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第28页,抗体保留在不吸附蛋白质材料中，如储存抗体中蛋白浓度很低时（,10-100mg/l,），应另加隔离蛋白，以降低容器反抗体蛋白吸附，隔离蛋白惯用,0.1%-1.0%,牛血清白蛋白。绝大多数已稀释抗体应保留在,4-8条件下，以免冻融反抗体蛋白产生有害效应抗体原液和已分离免疫球蛋白组分应保留于-20条件，防止重复冻融。冷冻抗体溶液应置于室温中迟缓地解冻，应绝对防止用高温快速解冻。被细菌污染抗体常会出现假阳性结果，为了预防细菌污染，可在抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20以下能够保留2-3年，保留稀释后单抗应加入0.1%叠氮钠。大多数稀释抗体不可进行冷冻保留，多数抗体可能会丢失抗原活性，多数抗体只要蛋白浓度适当，可在4下保留数月。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第29页,四、,免疫组化增强染色方法，可采取几个形式,不溶性氧显色剂产物可见度可经过金属离子或有机化合物增强。比如将免疫染色切片浸泡于,0.5,硫酸铜溶液、,0.125%,四氧化锇、,1,氯化钴、,或,1,硫酸镍铵中，能够依据使用不一样溶液而改变其反应产物颜色以增加可见度,12,但并不提升免疫染色灵敏度。在应用黑白显微摄影技术时，这些方法较有效，如锇黑色能增强与苏木素，甲基绿或钴兰绿等背景染色形成强烈对比,。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第30页,其它技术如用咪唑也能够实现免疫染色增强，由辣根过氧化物酶介导,DAB,过氧化反应能够被各种含氮化合物增强，咪唑是最有效一个。另一项免疫染色增强技术尤其适合用于组织内抗原数量很低时，重复使用初级抗体，开始抗体孵育过程很短，接着,PBS,冲洗，然后再次与同一浓度初级抗体进行反应，并在,4,“孵育”过夜，这一过程也能够颠倒即先一抗,4,孵育过夜（或室温下）然后,PBS,洗，再次反应。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第31页,五、免疫组化中固定，这也是免疫组化好坏关键,有证据表明当前石蜡包埋处理组织降低了能够检测抗原数量,15,。,、冰冻组织,在新鲜冰冻组织中细胞表面抗原及其它组织抗原，仅需极少许组织即可被检测到，而在常规操作及蜡块包埋时这些抗原可能完全丢失。所以新鲜组织冰冻切片仍是抗原保留金标准。,未被冰冻组织必须马上固定，以免变干，不然抗原将“失活”。若抗原长久暴露于固定剂后将被毁掉，所以用于免疫组化目标组织，应尽可能短时间固定，即刻包埋。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第32页,、醛固定剂,甲醛是诊疗试验室中被广泛应用固定剂，组织在,10,缓冲甲醛中，保留很长时间仍可保持令人满意细胞形态，但长时间固定于甲醛中绝对是免疫组化不值得提倡，抗原保留量与固定时间负相关。很各种普通组织抗原在连续固定后丢失。非肿瘤组织多组织块固定于甲醛,3,天后，抗原染色密度显著下降，,7,天后大多数抗原丢失。,VimeNtiN,和,DismiN,即使固定于甲醛中一天也会丢失很多。尤其是尸检组织常固定较长时间，影响免疫组化结果。所以要想取得各种抗原满意结果，固定时间最好不要超出,6-8,小时。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第33页,非交联固定剂,不一样固定剂反抗原有不一样保留结果，如,Carroy,溶液,(60,乙醇、,30,氯仿、,10,冰醋酸,),，,methacarN(60,甲醇、,30,氯仿、,10,醋酸）和,95,乙醇更适合于检测组织中,VimeNtiN,。,BouiN,溶液能很好保留,N,肽及生物胺。重金属固定剂如,B5,和,ZeNker,溶液更适合于一些核抗原免疫组化检测，但这些固定液常使背景染色增加，对于环境又是一个有毒污染物。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第34页,过碘酸盐,-,赖氨酸副甲醛溶液能氧化糖类，产生交联、稳定脂质和蛋白，并保留形态完整，较适合于淋巴细胞膜抗原保留。并较适合用于雌激素受体蛋白免疫染色。,当固定剂中含有酸性物质时最易造成抗原丢失，可能是蛋白质三级，四级结构受损，所以使用中性或靠近于生理,PH,值固定剂可取得最满意形态及抗原保留效果。所以现在提倡使用缓冲甲醛固定液。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第35页,细胞涂片固定,100%,乙醇最为惯用，在免疫染色准备中通常是先用乙醇固定尔后脱落细胞巴氏染色。,SuthipiNtawoNg,等发觉将空气干燥涂片在,0.1,甲醛盐溶液中固定,14,小时，随即在,100,乙醇溶液中,10,分钟，可得到组织抗原保留最正确效果，同时还能够降低背景染色。这一个固定方法可使样品在室温下保留一周，或在,-70中保留,5,周，便于涂片及细针抽吸样品空气干燥，并进行试验研究，而无须担心固定过程中抗原丢失。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第36页,、初级固定微波照辐射,加热能使蛋白质部分变性，但加热从未在固定剂中广泛应用，微波,(MW),加热技术出现克服了生物组织导热性能差限制，提供了一个清洁而快捷产生稳定热量方法。在过去,10,年微波辐射作为一个快速组织固定法而得到广泛应用，而且成为甲醛优良替换物用于细胞抗原保留，将样品切成,2,毫米厚浸泡于生理盐水，,MW,辐射温度至,62C,，随即组织将放在,100,乙醇和氯仿或二甲苯中循环处理,3.5,小时，然后借助真空技术进行石蜡包埋，对于细针抽吸或内镜活检材料可处理时间稍短些，约,65,分钟左右，应用,MW,代替甲醛作为固定剂及在自动处理过程中放弃使用甲醛，不但消除了有毒和含有潜在毒性试剂危害，而且实现了从各种组织中取得高质量诊疗切片快捷准备办法。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第37页,MW,固定组织以保留抗原方法显著优于,10,中性甲醛固定组织，除了能对各种抗原免疫染色有很好效果外，其形态学保留效果也很出众。甲醛固定组织从,5,小时起其免疫染色程度低于对应,MW,切片。,MW,还能够保留大量不稳定淋巴细胞抗原，这些抗原在甲醛固定或石蜡包埋后通常被丢失。,MW,对于,CytokeratiN,和,DismiN,没有影响，所以对这两种抗原检测，,MW,组织无需在免疫染色前进行酶预处理。,MW,固定既改变了传统甲醛固定引发污染毒性，同时它含有使石蜡组织更加好保留抗原优点。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第38页,、重金属溶液固定,重金属盐如锌盐已被作为一个有效蛋白沉淀剂产生不溶性复合物，多肽锌甲醛作为一个固定剂可增强免疫染色。有研究表明组织固定后浸泡于硫酸锌中也可改进免疫染色效果。据介绍锌甲醛,(1,硫酸锌，溶于,3.7,非缓冲甲醛中）用于自动组织处理法中较使用中性缓冲甲醛溶液能取得更加好抗原保留效果，值得注意是它反抗原并没有严重影响与损坏,19,。现在有加热诱导抗原保留技术，所以没有必要与足够理由去使用像重金属这么环境污染物。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第39页,六、抗原,(,决定簇,),热修复,组织在甲醛或其它固定液中固定会引发位于蛋白内或蛋白间亚甲基桥桥连，即甲醛可使蛋白质凝固，引发蛋白质交联，进而引发许多抗原决定簇被封闭，妨碍抗原抗体结合，断开交联，暴露抗原决定簇，使抗原抗体充分结合，以到达抗原修复作用。最惯用抗原修复技术是酶消化或热引导抗原决定簇修复（,heat-iNduced epitope retrieval,，,HIER,）。,Cattoretti,等报道用,10mmol,枸椽酸盐缓冲液,(PH6.0),使用,MW,处理，能增加抗体稀释度，增强染色与降低“孵育”时间，这是一个重现抗原步骤，其它作者拓展了这一方法，显示了该法对各种诊疗性抗体都有效。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第40页,该法详细过程为，脱蜡重新水化切片置于,10mmol(PH 6.0),枸椽酸盐缓冲液中，,(2.1g-,水枸橼酸溶于,900ml,蒸镏水，使用,13ml 2mol NaOH,调整,PH,至,6.0,）置于家用微波炉内，将能量调至最高，直至样品沸腾，该热溶液被弃去或用蒸镏水再次加满，重复以上过程，当再次到达沸点时加热停顿，切片在免疫染色前在热缓冲液中再浸泡,25,分钟，如组织曾经固定较长时间该法可重复使用。该法用于当前大多数诊疗性抗体，能大大改进染色结果。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第41页,如最常易被甲醛固定，石蜡包埋而掩盖抗原,CD19,，抗体稀释倍后仍有染色。也有些抗原应用此方法并不增加免疫染色，如,H222,克隆,ER,，,mPR3,克隆,PgR,、,CD21,、,CD35,、,Mac387,、,LM,、,IV,型胶原等。有时此法联合使用酶消化能够改进一些抗原染色。最近该法又深入改进，将切片置于枸椽酸盐缓冲液密闭玻璃容器中，微波辐射至沸腾，然后调整微波使缓冲液一直处于沸腾状态,10,分钟，然后在热缓冲液中再浸泡,25,分钟，能够大大增强灵敏度。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第42页,使用,HIER,时注意两点：,抗体孵育前每一步操作均不能使组织干燥，,加热后放置足够时间，使之变凉（最少10-20分钟），可假设为允许蛋白恢复到它自然结构。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第43页,除了枸橼酸盐缓冲液外，还有几个“抗原重现”试剂,EDTA,，,Tris-Hcl,，氯化铵或商品化靶修复液。用微波辐射,0.05mol/L,甘氨酸盐酸,(PH3.5),中组织切片能够检测核抗原免疫染色，用微波辐射,4M,尿素中切片，能够显示细胞及膜表面免疫球蛋白有效,23,，还能够用高压锅、电饭煲、电炉、电水壶等代替微波炉产生高温加热，也有抗原重现作用。,EDTA-HIER,作用机制是经过钙离子鳌合而实现，而且这种鳌合作用只有在碱性,PH,值下才起作用，枸橼酸盐缓冲液作用似乎也是经过此作用。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第44页,酸性抗原修复液如,Tris-Hcl,似乎经过高浓度氢离子离解了钙离子复合物或打断了福尔马林固定产生交联而实现。抗原修复液中,PH,值也至关主要，多数抗原在偏碱性,PH,值时效果好。对固定时间很长非常旧档案资料，酸性,PH,值抗原修复液工作效果优于碱性,PH,值修复液。检测细胞膜或细胞浆抗原时，应用柠檬酸盐（CB）或EDTA缓冲液进行微波3档10分，效果，EDTA缓冲液作用优于CB，但有时可出现背景着色。检测细胞核抗原用CB，高氏处理较为理想，酶消化几乎没有作用，但这种方法对切片要求高，须预防脱片现象。检测细胞外间质抗原用酶消化好，尤其是复合酶是最正确选择。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第45页,七、抗原保留几项特殊技术,、冻干,组织置于,-45,10,-2,torr,有,P,2,O,5,中,48,小时能将组织冻干，随即进行石蜡包埋，对于保留淋巴细胞膜上不稳定抗原有效。但该法设备特殊、昂贵，组织干、硬、脆、切片后形态学效果差。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第46页,、丙酮和丙酮,-,甲基苯甲酸盐,-,二甲苯,(AMEX,法,),丙酮为一个澄清无色易燃液体，在水、乙醇及大多数有机溶剂中均能溶解，作为脱水剂已广泛用于组织处理，而且比乙醇等脱水剂更易挥发。丙酮易燃故不用于自动化处理过程，组织长久接触丙酮会变脆，丙酮作为细胞学中抗原固定剂，主要用于显示淋巴细胞膜抗原。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第47页,最近丙酮在,AMEX,技术中充当固定剂，将组织固定于丙酮中,-20,过夜，随即用甲基苯甲酸盐及二甲苯清洗，尔后石蜡包埋，所得到组织学效果据称比冰冻切片更加好而且仍保留了淋巴细胞不稳定抗原，这些学者声称从,AMEX,法固定组织中可提取出与新鲜组织一样多蛋白质。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第48页,、塑料包埋,在适当固定后用新型塑料包埋组织，可取得良好细胞形态学和抗原保留，用副甲醛、丙酮或,BouiN,液固定后在低温,(4,时,),用多聚酶树酯包埋。,、冰冻替换法及塑料包埋,即用冰冻替换法配合低温塑料包埋防止了组织固定而且含有比固定、包埋组织及低温、恒温切片更优越形态学保留效果。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第49页,八、脱钙溶液和组织处理,很多汇报都显示了,EDTA,、甲酸、,10,醋酸几乎都不影响免疫反应，即使经过长达,7,周脱钙过程,但,5%,硝酸脱钙将造成免疫反应减弱，此时，用蛋白酶消化可稍加改进，三氯乙酸被认为是一个较有效一步脱钙固定剂。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第50页,相关脱钙组织中抗原保留详细研究较少，,60,以上可引发抗原失活，细胞形态丧失，尤其是核结构，所以浸蜡最好在,60,以下进行。必要时使用低溶点蜡。组织切片在,58,烤干与,37,相比，前者抗原显著丢失,28,，不过抗原重现溶液在沸点有效使用说明温度对于所受加热为湿热固定组织并不是一个关键原因。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第51页,九、免疫组化染色方法,、传统免疫组化染色,各种免疫组化方法使用取决于各人兴趣，免疫染色方法中任何一步都可能隐藏着陷井，如阻断内源性过氧化物酶和过氧化物酶样酶失败可造成假阳性结果，非特异性背景染色，尤其是结缔组织及胶原染色，是免疫过氧化物酶染色中最令人讨厌。如普通血清或牛白蛋白预先孵育能够降低背景染色。应用最大可能稀释初级抗体一样有利于降低无须要背景染色。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第52页,多数初级抗体室温孵育为,20-30,分钟，将温度提升到,70,时，能够缩短孵育时间，但可能由此而增加背景染色而影响结果，最好是应用初级抗体最低浓度,4,过夜（室温,22,过夜也有报道）。有些效价低单克隆抗体或不易于与抗原结合抗体，,4,过夜有时染色效果并不理想，可能是温度影响了抗体生物活性，降低了二者特异性结合速率。提升温度无疑是克服上述问题方法之一。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第53页,但应使用高质量抗体稀释液来稀释一抗或使用商品化抗体工作液，因为二者均含有抗体保护剂和稳定剂，这么才能使提升抗体孵育温度成为可能。详细步骤是加完一抗后，把组织切片置于密封很好湿盒内，室温,18-20,过夜，有空调设备房间或使用恒温培养箱更为适宜。这么能够较准确地控制试验温度，保持免疫组化染色外部条件稳定。,应该强调是组织切片在操作过程中不能晾干，不然会产生假阴性。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第54页,、微波刺激免疫染色,微波辐射能够降低初级抗体孵育时间，能够取得较佳细胞形态学保留效果和更洁净背景,29,，微波还可用于石蜡切片染色中初级抗体、次级抗体、过氧化物酶复合物等全部阶段孵育，还可用于加速阻断步骤，整个染色时间大约,16,分钟,30,，所以尤其适合用于紧急、或特殊情况时所需即时染色及快速取得结果。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第55页,、预先染色切片免疫组化染色,对,HE,切片重新进行免疫组化染色，多采取于,ABC,方法，移去盖玻片后，用酸性乙醇对苏木素、伊红进行短时间脱色，随即针对性进行免疫染色，该法并不影响抗原检出。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第56页,、复染,普通来讲免疫组化切片不需复染。但为了识别一些细胞类型，复染是有用。普通为轻微复染，惯用于核复染是苏术素和甲基绿，钴蓝,B,与甲基绿含有相同性质，尤其适合用于切片中将黑色素染成蓝,-,绿色，这使得,DAB,棕色原本难以区分黑色素变得易于区分了。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第57页,十、蛋白酶解消化,10,缓冲甲醛是诊疗试验室中最通用固定剂，这种固定剂易使蛋白质产生交联，使抗原分子抗原决定簇被掩饰，用蛋白酶对组织切片进行预处理，能够打开抗原分子间交联，重建其免疫反应活力。蛋白酶消化能够增加细胞和组织，使抗原和抗体最大程度地结合。胰蛋白酶消化最早用于石蜡切片免疫荧光染色，现已广泛用于免疫组化。除胰蛋白酶外，还有胃蛋白酶、水解酶和链霉菌酶等，牛胰蛋白酶，,0.1%,胃蛋白酶最为惯用，消化时间取决于抗原掩盖强度，蛋白酶消化时间与甲醛固定时间成正比,32,相比较乙醇固定组织显示了很好抗原保留，尤其是,VimeNtiN,，在乙醇中经不一样时间长度固定后，免疫染色效果无显著区分。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第58页,有学者指出固定于95乙醇和固定于甲醛-乙醇(90ml 80%乙醇，10ml浓甲醛和0.22g醋酸钠)中组织抗原保留相对范围相同，而固定于10甲醛组织，其大量抗原将无法标识。乙醇除了能够很好保留胞浆中VimeNtiN外，对于其它抗原并不是一个优越试剂，而且乙醇固定形态学，表现为组织皱缩，核染色质聚集及嗜碱性增强。在生理盐水中用微波辐射固定使组织直接经纯乙醇处理而防止这些缺点。胃蛋白作用强，但偏酸性，易造成组织结构破坏。抗原修复液胰蛋白酶普通用于细胞内抗原，膜抗原慎用。复合酶（胰蛋白酶为主）浓度增高，并含有稳定剂，PH7.2，主要用于细胞外间质抗原检测。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第59页,适当酶消化有利于降低背景染色而增强特定抗原免疫反应，但可能会出现假阴性。也有些情况酶消化反尔产生背景染色及假阳性。过分消化会破坏细胞完整性使抗原丢失，酶消化还易于引发掉片。可使用绿矾酸，,ELMER,凝胶和多聚赖氨酸等作为粘合剂来处理掉片这一问题。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第60页,十一、免疫组化染色质量确保,对于不一样抗体特异性、相同抗体克隆不一样起源、相同克隆冠以不一样名称出售、以及其它问题不停出现，强调了要认真制订一个诊疗性免疫组化质量确保，各种酶联抗体，显色剂，药盒等能够经过各种商业路径购得，当前已经有,300,各种免疫试剂及抗体有售，不停增加抗体数目，不停成为可商业购得商品，却没有统一灵敏度及特异性标准。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第61页,不一样克隆所要检测是相同抗原，相同抗原可作为浓缩形式或未稀释形式，还可作为培养基上清液，或即用型液体出售，同一商品可在不一样分销商名下作为不一样名称商品出售，购置者所购置试剂无须去证实制造商及分销商所声称灵敏度和特异性，而且有趣是全部商业抗体都标明“非诊疗用”，但实际上这些抗体正是用于诊疗这一目标。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第62页,关于免疫组化染色标准问题最初是由美国生物染色委员会,(Biological staiN commissioN USA),一项小研究而引发，该组织评定了,5,家独立试验室针对,3,种多发性肿瘤块进行单纯抗,-,角蛋白抗体染色，所报道染色形式在所参加,5,家试验室中有显著差异,34,，另一项关于乳腺癌中激素受体免疫染色在多家试验室研究中也得到了不尽相同结果。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第63页,毫无疑问，免疫组化如能正确应用，确实是一个有力而又有用诊疗工具，它为外科病理学家提供了高水准专业服务，补充了他们观察技巧，拓宽了形态学诊疗潜能。为了确保免疫染色高质量，,我们对切片处理方面全部问题都应认真考虑与检验，以确保组织抗原最正确保留。免疫组化在未完成之前无可靠检测伎俩，染色结果常重复无常，这与许多原因相关，如抗原保留，蛋白酶消化，增强技术及反抗体管理、使用和试剂浓度，所以稳定质量保持比其它试验室技术更困难，除非进行大量免疫组化操作，不然保持好质量与取得合理经验是极难。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第64页,每次使用新抗体时都必须检测其最正确稀释度、使用免疫组化方法与组织固定等。但使用一些试剂盒或即用型试剂，能够降低上述麻烦，使用方便。但试剂盒也有其本身缺点，这些即用型已稀释过抗体给人有一个方便与稳定假象，一些试剂盒无法到达期望效果，但又难以将这些试剂定为假货。药盒即用型试剂由制造商设计成适合全部使用者，其试剂浓度并不是最正确浓度，因为各个试验室有不一样固定与组织处理方法，所以使用即用型试剂结果常并不是最正确结果。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第65页,免疫染色质量控制需要设置对照组，包含已知存在抗原阳性对照组，如含抗原正常组织，最好是使用含少许抗原瘤组织作为对照，使与所检测切片中抗原水平趋于一致，而且后者可能含有表示抗原非瘤组织，能够作为内部对照。阴性对照，应用缺乏抗原组织切片。空白对照，即采取非免疫血清，缓冲液，或其它无特异性抗体（最好是同一免疫球蛋白类型）以取代初级抗原位置或用抗原预先吸附抗体而除去阳性染色，这常是可靠对照，但因为该法不实用而未被常规使用。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第66页,试验室在确定使用新抗体之前，使用者应该了解以下情况：,、确定对于所要研究抗原最敏感抗体；,、检测抗体最正确工作浓度；,、熟悉相关试剂灵敏度、特异性、尤其应了解哪些组织表示这些抗原，确定免疫染色方法及细胞中抗原分布，这将有利于确定阳性染色，尤其是当细胞表示水平低时尤为主要,。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第67页,、使用于诊疗样品之前，应用阳性切片进行预试验以取得使用抗体经验；,、在试验室中应有一份该试剂已出版文件作为参考资料，对于非特异性染色假阳性等情况，要心中有数，以防止不确切解释、推论等。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第68页,优异免疫组化切片观察,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第69页,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第70页,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第71页,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第72页,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第73页,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第74页,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第75页,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第76页,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第77页,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第78页,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第79页,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第80页,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第81页,十二、免疫组化染色说明与缺点,、免疫组化染色形式，病理学家在免疫组化染色中不应只限于熟悉阳性反应特征，还应注意染色中各种改变，因为不一样组织、固定处理方法、及抗体特征，免疫组化染色结果有改变。不正确结果常起源于技术性错误或阐述错误。真正阳性染色应是将所研究特异细胞染成棕色，尤其是单个细胞在一群细胞中或一个肿瘤中异源性染色。在,DAB,显色中阳性反应棕色颗粒能够显示单个细胞胞浆、细胞膜、核周区域、细胞核或仅限于胞浆一个区域，如细胞一极等。弥漫棕色或单一黄色肿瘤细胞染色可能是非特异性。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用专家讲座,第82页,多数用于肿瘤诊疗免疫标识物定位于胞浆或细胞膜表面，如,CEA,、,HBSAg,等，表示于细胞核有,P53,、,ki-67,、,LamiN,、,CycliN D1,雌激素，孕酮及雄激素蛋白。定位于细胞核及膜上表示抗原有,NE,、,LN,2,(CD74),、,S-100,蛋白等，核膜上表示有,C-erbB-2,表面免疫球蛋白等。抗原特异性分布形式有,CD30,在,R-S,细胞显示膜标识，核周高尔基