干扰素的生产工艺.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,干扰素生产工艺,干扰素的生产工艺,第1页,汉字名称：,干扰素,英文名称：,interferon;IFN,药品类别：,抗肿瘤药，抗病毒药,所属类别：,生物反应调整剂,干扰素的生产工艺,第2页,干扰素介绍,70年代中期人们发觉慢性乙型肝炎患者本身产生干扰素能力低下，在应用外源性干扰素后，不但产生了上述抗病毒作用，同时能够增加肝细胞膜上人白细胞组织相容性抗原密度，促进T细胞溶解感染性肝细胞效能.,干扰素的生产工艺,第3页,现实状况,当前可供临床选取干扰素种类很多。比如国产重组 IFN1型和IFN2型，进口干扰能（IFN2b）、罗扰素（IFN2a）、惠福仁（类淋巴母细胞干扰素）及组合干扰素等等。,干扰素的生产工艺,第4页,类别,各种亚型干扰素-（含1或2或2a或2b）疗效近似；干扰素-（IFN）也有相同效果，但它在肌肉组织中易被灭活。干扰素-制剂进入血液后，稳定性差，确切疗效尚在观察中，但可作为干扰素-替换制剂。,干扰素的生产工艺,第5页,什么是干扰素（IFN）?,干扰素是由病毒和其它种类干扰素诱导剂，经过刺激网状内皮系统（人体免疫系统一个）、巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞所产生一个糖蛋白。这种蛋白含有各种生物活性，包含抗增殖、免疫调整、抗病毒和诱导分化作用。,干扰素的生产工艺,第6页,干扰素相对分子质量小，对热稳定，4可保留很长时间，-20可长久保留其活性，56则被破坏，pH（酸碱度）210范围内干扰素不被破坏。人体自然就能产生干扰素，经一定制剂加工过程也能制造成药品-干扰素制剂。,干扰素的生产工艺,第7页,药理作用：,1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是杀灭而是抑制病毒，它普通为广谱病毒抑制剂，对RNA和DNA病毒都有抑制作用。,2.抑制细胞增殖。干扰素抑制细胞分裂活性有显著选择性，对肿瘤细胞活性比正常细胞大5001000倍。干扰素抗肿瘤效果能够是直接抑制肿瘤细胞增殖，或经过宿主机体免疫防御机制限制肿瘤生长。,干扰素的生产工艺,第8页,3诱导细胞凋亡：干扰素能够诱导肿瘤细胞凋亡，从而杀灭肿瘤细胞。,4.干扰素对体液免疫、细胞免疫都有免疫调整作用，对巨噬细胞及NK细胞也有一定免疫增强作用。,干扰素的生产工艺,第9页,作用机制:,干扰素不能直接灭活病毒，而是经过诱导细胞合成抗病毒蛋白（AVP）发挥效应。干扰素首先作用于细胞干扰素受体，经信号转导等一系列生休过程，激活细胞基因表示各种抗病毒蛋白，实现对病毒抑制作用。,干扰素的生产工艺,第10页,适应症：,1.用于各种恶性肿瘤，包含毛细胞白血病、慢性白血病、非何淋巴瘤、骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌、晚期转移性肾癌及胰腺恶性内分泌肿瘤、黑色素瘤和Kaposi肉瘤等。,2.与其它抗肿瘤药品并用。,3.作为放疗、化疗及手术辅助治疗剂。,4.病毒性疾病防治。,干扰素的生产工艺,第11页,不良反应：,1.全身反应主要表现为流感样症状，即寒战、发烧和不适。,2.骨髓抑制在用药中可出现白细胞、血小板和网状红细胞降低。,干扰素的生产工艺,第12页,3.局部反应部分患者在注射部位可出现红斑，并有压痛，二十四小时后即可消退。4.其它脱发、皮疹、血沉加紧、嗜睡、一过性肝损伤。偶见过敏性休克，用药前作过敏试验。,干扰素的生产工艺,第13页,临床上惯用干扰素有哪些制剂,自然干扰素,人体白细胞重组干扰素,复合干扰素,干扰素的生产工艺,第14页,相关药品国内生产企业,1.1b干扰素 中国预防医学科学院 卫生部长春生物制品研究所 卫生部上海生物制品研究所 深圳科兴生物制品有限企业（赛若金）,2.人2a干扰素 卫生部长春生物制品研究所 广州医学院 沈阳三生制药股份有限企业（因特芬）海南新大洲药业有限企业（贝尔芬）浙江东阳市吴守联合生物技术研究所 深圳科兴生物制品有限企业 武汉天奥制药有限企业（栓剂）,干扰素的生产工艺,第15页,3.人2b 干扰素 长春生物制品研究所 安徽安科生物高科技有限企业(安达芬)丽珠集团苏州新宝药厂（隆化诺）哈尔滨金亚哈尔滨生物制品有限企业（利能）上海华新生物高技术有限企业 天津华立达生物工程企业 苏州新良药厂,4.人干扰素 上海生物化学研究所 中国预防医学科学院 卫生部上海生物制品研究所 第二军医大学 上海克隆生物高技术有限企业 珠海丽珠制药有限企业,干扰素的生产工艺,第16页,干扰素生产工艺路线:,路线1：,体外诱生干扰素制备工艺,：,Sendai病毒诱导人白细胞,1989年：IFN-n3/Alferon，同意上市,产量低：1g IFN，需要 3亿ml人血白细胞,起源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵,潜在血源性病毒污染可能性,干扰素的生产工艺,第17页,路线2：,人源转化细胞系培养生产工艺：,1999年：IFN-n1/Wellferon,同意用于临床。,优点：首次实现大规模商业化生产。,缺点：活性低，退出临床应用。,干扰素的生产工艺,第18页,路线3：,基因工程大肠杆菌发酵生产工艺,:,上市产品：重组人干扰素rhuIFN,1986，rhuIFN-2a，rhuIFN-2b；,1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b；,：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys,表示产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体,工艺特点：发酵过程，随即变性、复性过程。干扰素的生产工艺,第19页,路线4：,动物无限细胞系培养生产工艺：,上市产品：rhuIFN-1a,1996，Avonex(Biogen)；,，Rebif(Serono),表示产物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku,工艺特点：分泌表示，产量低，成本高,过程严格,干扰素的生产工艺,第20页,路线5：,基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺：,宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida）,上市产品：IFN-2b/安福隆,表示产物：无糖基化可溶性蛋白质，含有天然分子,结构和生物活性,工艺特点：,发酵周期短：几个小时,无需变性、复性过程，取得有活性产品,纯化过程：淘汰抗体亲和层析,干扰素的生产工艺,第21页,基因工程假单胞杆菌构建与保藏,基因工程假单胞杆菌菌种建立：,第一步：干扰素-2b基因克隆,第二步：表示载体构建,第三步：工程菌构建,干扰素的生产工艺,第22页,第一步：干扰素-2b基因克隆,制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR，,基因连接质粒,转化E.coli,筛选判定克隆。,测序：编码人IFN-2b基因序列,501bp，165aa。,干扰素的生产工艺,第23页,第二步：表示载体构建,IFN基因与表示载体连接,转化大肠杆菌,筛选阳性克隆,取得序列正确表示载体,干扰素的生产工艺,第24页,第三步：工程菌构建,转化假单胞杆,筛选高表示、稳定遗传工程菌,取得原始菌种,干扰素的生产工艺,第25页,菌种库建立与保藏,QC：菌种特征、生产能力、质粒稳定性,菌种检验合格后，方可投产。,干扰素的生产工艺,第26页,干扰素,-2b,发酵工艺过程,干扰素的生产工艺,第27页,摇瓶培养：,取保留工作种子批菌种，室温融化,摇瓶培养：30，pH7.0，250 r/min，182h,检测：OD值和发酵液杂菌检验。,干扰素的生产工艺,第28页,种子罐培养：,接种：接入50L种子罐，接种量10%。,培养：30，pH7.0。,控制：级联调整通气量和搅拌转速,检测：显微镜和LB培养基划线检验，控制杂菌。,干扰素的生产工艺,第29页,发酵罐培养：,接种：通入300L培养基发酵罐，接种量10%。,控制：级联调整通气量和搅拌转速。,前4h：30，pH7.0，DO为30%。,4h后：20，pH6.0，DO为60%，56.5h。,终点控制：OD值达9.01.0，5冷却水快速降温至15以下。,检测：发酵液杂菌检验,干扰素的生产工艺,第30页,菌体搜集：,连续流离心机：冷却发酵液，16000 r/min离心搜集。,菌体保留：20冰柜，不超出12个月。,检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。,干扰素的生产工艺,第31页,干扰素-2b分离工艺过程,菌体裂解,预处理,离心,初级分离,干扰素的生产工艺,第32页,1.菌体裂解：,裂解缓冲液：纯化水配制，210（pH7.5）,使用保护剂：EDTA，PMSF。,破碎20菌体：2厘米以下碎块,搅拌：加裂解缓冲液，210，2hr,冻融:细胞完全破裂，释放干扰素。,干扰素的生产工艺,第33页,2.预处理-沉淀：,加絮凝剂聚乙烯亚胺:,210，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。,加凝聚剂醋酸钙溶液:,210,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。,干扰素的生产工艺,第34页,3.离心：,连续流离心机：210，16000 r/min,搜集上清液：含有重组干扰素蛋白质,杂质沉淀：121、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。,干扰素的生产工艺,第35页,4.初级分离：,盐析:4M硫酸铵，210，搅匀,静置过夜。,离心：连续流离心机，16000 r/min,保留：搜集沉淀，粗干扰素，4保留。,干扰素的生产工艺,第36页,干扰素纯化工艺过程,溶解粗干扰素,沉淀与疏水层析,阴离子交换层析与浓缩,阳离子交换层析与浓缩,凝胶过滤层析,无菌过滤分装,干扰素的生产工艺,第37页,1.溶解粗干扰素,配制纯化缓冲液：,超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 m滤器和10 ku超滤系统，百级层流下搜集。冷却至210。,检验:缓冲液pH值和电导值。,溶解：,210，匀浆，完全溶解。,干扰素的生产工艺,第38页,2.沉淀与疏水层析,等电点沉淀（1）：磷酸调整至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心搜集上清液。,疏水层析：,洗脱与搜集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）。,等电点沉淀（2）：磷酸调整pH4.5，调整电导值40 ms/cm，210，静置过夜,干扰素的生产工艺,第39页,超滤：1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。,透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku超滤膜，0.005 M缓冲液。,干扰素的生产工艺,第40页,4.阳离子交换层析与浓缩,用0.1M醋酸缓冲液（pH 5.0）平衡树脂。,上样，相同缓冲液冲洗。,盐浓度线性梯度550 ms/cm进行洗脱,配合SDS-PAGE搜集干扰素峰。,浓缩：10 ku超滤膜进行。,干扰素的生产工艺,第41页,5.凝胶过滤层析,洗涤液：0.15 M NaCl0.01M磷酸缓冲液（pH7.0）清洗系统和树脂,上样，相同缓冲液进行洗脱。,合并干扰素部分,干扰素的生产工艺,第42页,6.无菌过滤分装,0.22 m滤膜过滤干扰素溶液,分装,20以下冰箱中保留。,干扰素的生产工艺,第43页,7.检测项目,干扰素判别试验,干扰素效价测定,蛋白质含量，纯度测定，分子量,宿主残余蛋白、残余DNA,干扰素结构判定：紫外光谱，肽谱，N端序列,其它：热原，内毒素，残留抗生素,干扰素的生产工艺,第44页,演示完成！谢谢,干扰素的生产工艺,第45页,