离心技术和物质代谢实验.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,离心技术和物质代谢实验,离心技术和物质代谢实验,第1页,离心技术,概念,：,依据物质沉降系数、质量、浮力原因等不一样，应用离心力使物质分离、浓缩、提纯方法。,应用,：,分离、提纯、判别生物高分子；分离线粒体、染色体、微粒体、溶酶体等亚细胞物质。,离心技术和物质代谢实验,第2页,基础原理,F,：粒子在离心场中所受离心力,a,：粒子旋转加速度,m,：沉降粒子有效质量,：粒子旋转角速度,r,：粒子旋转半径,(cm),，,离心力,F,=,离心技术和物质代谢实验,第3页,RCF(relativecentrifugalforce),：相对离心力,rpm(revolutions per minute),：每分钟转速,低速离心时常以转速“,rpm”,来表示,高速离心时则以“,g”,表示,相对离心力,离心力相对于重力倍数，单位是,g,离心技术和物质代谢实验,第4页,沉降系数（,S,）,:,超速离心时，颗粒在离心场中沉降速度用沉降系数来表示，即物质在单位离心力场下沉降速度,。,单位：,Svedberg,，,1S=10,-13,s,是是物质特有物理常数，可间接反应分子量大小。,离心分离技术基础理论数据，与物质大小、形状、密度及介质密度、粘度都相关，经过对离心力和离心介质选择，即可分离纯化出不一样质量大小和物理形状物质离心技术和物质代谢实验,第5页,另外，对一些生物高分子或亚细胞器组分化学结构、分子量尚不了解时，可用沉降系数对其物理特征进行初步描述，将其区分开来，如原核生物核蛋白体,RNA,（,rRNA,）分为,5S,、,16S,、,23S,，即是依据其在离心场中行为来进行分类。,离心技术和物质代谢实验,第6页,离心机类型和主要结构,类型,工业用离心机,离心机 制备性离心机,试验用离心机,分析性离心机,普通离心机,：,6000rpm,高速离心机：,6000,0rpm,超速离心机：,0rpm,制备性离心机,离心技术和物质代谢实验,第7页,主要结构,转头，离心管和管帽，制冷系统，真空系,统，制动装置，指示表盘,离心技术和物质代谢实验,第8页,转头,1,角式转头,离心技术和物质代谢实验,第9页,2,荡平式转头：,这种转头是由吊着,4,或,6,个自由活动吊桶,(,离心套管,),组成。,3,区带转头：,区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开顶盖组成。,4,垂直转头：,其离心管是垂直放置。,5,连续流动转头：,转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口转头盖及从属装置组成。,最大额定转速,一定使用程度，使用一定次数或一,定时间后递减,10%,。,离心技术和物质代谢实验,第10页,离心管,不锈钢和,塑料,离心管，管帽预防样品溢出。,离心技术和物质代谢实验,第11页,离心操作注意事项,使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地,平衡,离心管和其内容物，转头中绝对不能装载单数管子，当转头只是个别装载时，管子必须相互对称地放在转头中，方便使负载均匀地分布在转头周围。,每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。,离心技术和物质代谢实验,第12页,装载溶液时，要依据各种离心机详细操作说明进行，依据待离心液体性质及体积选取适合离心管，有离心管无盖，,液体不得装得过多,，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀,;,而制备性超速离心机离心管，则经常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管上部凹陷变形。,若要在低于室温温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机转头室内,预冷,。,离心过程中不得随意离开,离心技术和物质代谢实验,第13页,物质代谢试验,试验二十一、糖酵解中间产物判定,血清胆固醇测定,血清甘油三酯测定,试验二十、邻甲苯胺法测血糖含量,离心技术和物质代谢实验,第14页,试验二十一,、糖酵解中间产物判定,【,试验目标,】,检测糖酵解中间产物磷酸丙糖生成。,【,试验原理,】,离心技术和物质代谢实验,第15页,糖酵解反应过程见下列图：,离心技术和物质代谢实验,第16页,将酵母液（含有葡萄糖及糖酵解全部酶）在一定介质中（适宜,pH,，必要金属离子等）进行保温，在酵母液中酶体系作用下，酵母液中原来含有糖就进行酵解反应，当反应进行到生成二分子磷酸丙糖，深入改变是在,3,磷酸甘油醛脱氢酶,催化下进行,，,SH,为,3,磷酸甘油醛脱氢酶必需基团，加入,一碘醋酸可与此酶,SH,起反应,，从而使酶失去活性，酵解反应就停留在磷酸丙糖阶段。,酶,-SH+ICH2COOH,酶,S-CH2COOH+HI,离心技术和物质代谢实验,第17页,然后以,硫酸肼,为稳定剂，保护磷酸丙糖不致自发分解，使其不能向其它方向改变，结果磷酸丙糖在反应体系中堆积，从而与,2,，,4,二硝基苯肼,反应生成对应,苯腙,，后者在碱性溶液中溶解呈,紫红色,，可借此判定丙糖之生成。,离心技术和物质代谢实验,第18页,离心技术和物质代谢实验,第19页,【,试验方法,】,取试管,3,支，编号，按下表进行操作,统计三管所发生情况，并加以简明分析,CCL3COOH,作用：强酸，使糖酵解全部酶失活。,一碘醋酸作用：使,3,磷酸甘油醛脱氢酶失活。,硫酸肼作用：稳定磷酸丙糖，使其不向其它方向转变。,离心技术和物质代谢实验,第20页,试 剂（,ml,）,1,2,3,pH7.4,磷酸盐缓冲液,一碘醋酸,硫酸肼,10,CCL3COOH,酵母液,水,2.0,0.5,0.5,1.0,4.0,2.0,0.5,0.5,4.0,1.0,2.0,4.0,2.0,混匀，在,37,38,恒温水浴中保温,30,分钟,一碘醋酸,硫酸肼,10,CCL3COOH,水,2.0,1.0,1.0,0.5,0.5,1.0,混匀，静置,10,分钟，,离心,3000,转,/min,10,分钟，再取三支试管，对号按下表操作,上清液,1mol/LNaOH,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,混匀，在室温放置,10,分钟,2,，,4,二硝基苯肼,1mol/L NaOH,0.5,3.5,0.5,3.5,0.5,3.5,离心技术和物质代谢实验,第21页,试验注意事项：,成腙反应前，溶液必须先碱化并在室温放置,10min,，目标是使磷酸丙糖中磷酸基水解脱去，生成颜色比较稳定；,一碘醋酸和三氯乙酸是酶抑制剂，使用移液管后必须,彻底清洗,移液管，不然易造成试验失败。,离心技术和物质代谢实验,第22页,血清胆固醇测定（酶法）,【,试验目标,】,1.,了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇原理。,2.,掌握血清胆固醇测定临床意义。,离心技术和物质代谢实验,第23页,血清中总胆固醇包含胆固醇酯,(CE,70%),和游离型胆固醇,(FC,30%),。胆固醇酯酶（,CEH,）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸（,FFA,），胆固醇在胆固醇氧化酶（,COD,）作用下氧化生成,4-,胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶（,POD,）催化与,4-,氨基安替比林（,4-AAP,）和酚反应，生成红色醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇含量呈正比，在,500nm,波优点测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇含量。反应式以下：,【,试验原理离心技术和物质代谢实验,第24页,1,.,标本：不溶血血清或血浆标本。血浆用肝素钠、,EDTA,抗凝，不可用草酸盐、氟化物。,2.,取试管,3,支，编号，按下表操作。,【,试验方法,】,加入物（,ul,）,测定管,标准管,空白管,血清,10,-,-,胆固醇标准液,-,10,-,蒸馏水,-,-,10,酶应用液,1000,1000,1000,离心技术和物质代谢实验,第25页,【,计算,】,A,标本,CHO,（,mmol/L,）,=,标准液浓度,A,标准,【,标准液,】,胆固醇,5.17mmol/L,（,200mg/dL,）,【,正常参考范围,】,3.10,5.70mmol/L,混匀后，,37水浴保温,15,分钟，在,500nm,波优点比色，以空白管调零，读取各管吸光度。,离心技术和物质代谢实验,第26页,血清甘油三酯测定（酶法）,【,试验目标,】,1,、了解酶法定量测定血清甘油三酯基础原理。,2,、掌握酶法定量测定血清甘油三酯试验方法。,离心技术和物质代谢实验,第27页,血清中甘油三酯经脂肪酶水解为甘油和脂肪酸，甘油在甘油激酶（,GK,）及,ATP,存在下，生成,3-,磷酸甘油，尔后，在磷酸甘油氧化酶（,GPO,）作用氧化成磷酸二羟丙酮并生成过氧化氢，过氧化氢与底物,4-,氨基安替比林和,ESPAS,在过氧化物酶（,POD,）作用下，生成红色亚醌化合物，其颜色深浅与甘油三酯含量成正比。在,500nm,波优点测定吸光度，与标准管比较可计算出血清甘油三酯含量。反应式以下：,甘油三酯,+4H2O,脂蛋白脂酶,甘油,+,脂肪酸,甘油,+ATP,甘油激酶,/Mg2+,甘油,-3-,磷酸,+ADP,甘油,-3-,磷酸,+O2,甘油,-3-,磷酸氧化酶,磷酸二羟丙酮,+H2O2,2H2O2 +ESPAS+4-,氨基安替比林,过氧化物酶,红色醌亚胺色素,+4H2O,【,试验原理,】,离心技术和物质代谢实验,第28页,1,.,标本：不溶血血清或血浆标本。血浆用肝素钠、,EDTA,抗凝，不可用草酸盐、氟化物。,2.,取试管,3,支，编号，按下表操作。,【,试验方法,】,加入物（,ul,测定管,标准管,空白管,血清,10,-,-,甘油三酯标准液,-,10,-,蒸馏水,-,-,10,酶应用液,1000,1000,1000,离心技术和物质代谢实验,第29页,【,计算,】,A,标本,甘油三酯（,mmol/L,）,=,标准液浓度,A,标准,【,标准液,】,甘油三酯,2.26 mmol/L,【,正常参考范围,】,0.56,1.71mmol/L,混匀后，,37,水浴保温,15,分钟，在,500nm,波优点比色，以空白管调零，读取各管吸光度。,离心技术和物质代谢实验,第30页,葡萄糖在浓酸溶液中（加在含有硼酸冰醋溶液中），水 浴加热至,100,左右，脱水生成羟甲基呋喃甲醛（或称羟甲基糠醛），后者能与邻甲苯胺缩合生成蓝绿色化合物，依据颜色深浅并进行,630nm,波长比色测定其含量。,试验二十、,邻甲苯胺法测血糖含量,【,试验目标,】,掌握邻甲苯胺法测定血糖原理及方法,【,试验原理,】,离心技术和物质代谢实验,第31页,1,）取试管四支，按下表操作,试剂（,ml,）,测定管（后,),标准管,空白管,血清,糖标准,蒸馏水,邻甲苯胺试剂,0.1,4.0,0.1,4.0,0.1,4.0,【,试验方法,】,2,）,混匀,，置沸水浴中加热,10,分钟，取出马上置冷水中冷却,3,）用,630nm,波长，以空白管校正吸光度为,0,，分别测定各管吸光度值,离心技术和物质代谢实验,第32页,4),计算,【,标准液,】,葡萄糖标准液,0.1 mg/ml,【,正常参考范围,】,3.9,6.1mmol/L,离心技术和物质代谢实验,第33页,