冬末春初圈养梅花鹿健康与腹泻个体粪便菌群的比较分析.pdf

基金项目:国家重点研发计划项目()作者简介:吴家慧 女硕士研究生 研究方向为动物种质资源保护与利用:.通讯作者 刘树强男副教授博士硕士生导师 研究方向为动物生理生态学:.胡德夫男教授博士博士生导师 研究方向为野生动物生态与管理:.收稿日期:冬末春初圈养梅花鹿健康与腹泻个体粪便菌群的比较分析吴家慧 石明慧 王一晨 韩香雨 吴怡宁蒋元琳 刘树强 胡德夫 商 业(.北京林业大学 生态与自然保护学院北京.辽阳千山呈龙科技有限公司辽宁 辽阳)摘 要 腹泻是制约梅花鹿()养殖发展的主要因素之一通常与肠道菌群失衡有关而健康与腹泻梅花鹿个体菌群组成变化尚不清楚 为探究健康与腹泻梅花鹿肠道菌群差异分析梅花鹿腹泻原因以圈养雄性梅花鹿为实验对象采集正常及腹泻梅花鹿粪便共 份通过 基因测序进行比较分析 研究结果表明腹泻组菌群丰度及多样性较健康组均有所下降 在门至属水平腹泻组理研菌科()、克里斯滕森菌科()等有益菌丰度下降 等促炎菌丰度上升 此外瘤胃球菌科()和理研菌科()在健康组中显著富集疣微菌门()、拟普雷沃氏菌属()、阿克曼氏菌属()在腹泻组显著富集 腹泻梅花鹿与健康梅花鹿粪便菌群组成和多样性存在显著差异疣微菌门丰度升高可能是导致梅花鹿腹泻的一个原因关键词 梅花鹿肠道菌群腹泻 基因测序疣微菌门阿克曼氏菌属中图分类号.文献标识码 文章编号 ():./.()(.)().微生物学杂志 年 月第 卷 第 期 .()梅花鹿()不仅是森林生态系统的重要一环也是我国饲养量最多的鹿类出产中医药原料鹿茸、鹿肉等鹿产品具有很高的经济及药用价值 腹泻是梅花鹿常见消化道疾病临床上以排便频繁且粪便不成形为主要症状发病率较高急性、慢性腹泻症状均有轻则导致梅花鹿健康不佳进而影响到鹿肉、鹿茸等产品质量重则致死严重危害养鹿业发展 梅花鹿的腹泻原因很多包括水质不洁、季节饲料更换、滥用药物等饲养管理因素以及寄生虫、细菌、病毒等生物因素 近年来的许多研究表明动物肠道菌群通过代谢产物和免疫调节活性影响宿主健康腹泻与肠道菌群多样性变化有关 例如厚壁菌门()可产生短链脂肪酸抑制炎症维持肠道健康 其丰度的下降会加剧肠道炎症导致腹泻 克里斯滕森菌科()可产生丁酸改善肠道屏障肠内丁酸的代谢水平与溃疡性结肠炎患者表现有关 菌群的紊乱可导致腹泻腹泻又可加重菌群失调形成恶性循环 随着 高通量测序的发展动物肠道菌群组成与消化系统疾病关系已成为研究热点是研究动物健康及科学管护的重要途径 比如利用高通量测序手段获取腹泻犊牛的菌群组成推测潜在致病菌为埃希氏志贺氏菌属()为犊牛腹泻防控提供一定理论依据 同时基于高通量测序手段可判断粪菌移植对腹泻仔猪肠道菌群的改善作用 本研究拟比较健康和腹泻梅花鹿的粪便菌群差异探寻梅花鹿腹泻与肠道菌群的关系为预防和治疗梅花鹿腹泻提供相应参考 材料与方法.材料.实验动物 年 月于辽阳国家鹿类种源繁育基地选择近 个月内未用过驱虫药、抗生素且年龄相近的成年雄性梅花鹿根据健康状况分为健康组()和腹泻组()腹泻鹿的粪便不成形粪水未分离参照羔羊腹泻标准应判为轻度腹泻.样品采集选择粪便正常的健康个体 只()腹泻个体 只()每日:(北京时间)进入圈舍使用一次性无菌手套采集新鲜粪便 选择粪便上层未接触地面的部分放入无菌自封袋中密封后标记采集日期、个体耳号等信息 采集完成后放入 冰箱冷冻保存等待后续处理.主要试剂与仪器设备 试剂盒(德国 公司).试剂盒(美国 公司)试剂盒(美国 公司)酶(上海东洋纺管理有限公司)微型离心机(北京天根生化科技有限公司)振荡器(美国 公司)仪(美国 公司)孔离心机(德国 公司)高速离心机(德国 公司)真空泵(/杭州米欧仪器有限公司)酶标仪(香港基因有限公司).方法.提取、扩增和测序 使用 试剂盒提取梅花鹿粪便的基因组 之后用琼脂糖凝胶电泳检测 的浓度、总量、纯度及条带完整性 以提取的样品 为模板使用通用引物()和 ()对细菌 基因的 区进行 扩增 反应体系():模板 上、下游引物(/)各.(/)酶(/).补至 反应条件:次循环 随后将 产物进行 扩增扩增产物进行 期 吴家慧等:冬末春初圈养梅花鹿健康与腹泻个体粪便菌群的比较分析 定量按(体积比)比例混样混样后采用.试剂盒纯化最后使用 试剂盒切胶回收 构建文库后在 平台对回收的 进行高通量测序测序工作交付给北京百迈客生物科技有限公司完成 测序原始数据上传到 数据库数据编号为.生物信息学分析对测序得到的原始数据进行拼接使用(.)将拼接得到的序列进行质量过滤随后使用()对双端序列进行拼接使用(.)去除嵌合体最终得到高质量序列使用()将优化处理后的序列在的相似度水平下进行分类操作单元()划分得到 以(:/.)为参考数据库使用朴素贝叶斯分类器对特征序列进行分类学注释在各分类水平上统计样品群落组成使用 软件生成不同分类水平上的物种丰度表并对样品进行 多样性分析和 多样性分析比较组间菌群丰度和多样性 利用 语言工具绘制各分类水平的群落结构图、分析图和 分析图 利用 软件对组间的物种丰度数据进行 检验采用 分析方法筛选出样品中具有统计学差异的菌群.统计分析应用 .软件对数据进行独立样本 检验数据结果以均值 标准差表示.差异具有统计学意义 结果与分析.测序水平通过 测序技术检测扩增的健康及腹泻梅花鹿粪便共 个样本的菌群 基因产物序列后续质控和纯化后健康组共获 得 条 有 效 序 列 腹 泻 组 共 获 得 条有效序列共获得 条序列(平均长度为.个碱基对)本研究在 序列相似度下聚类共获得 个 归类为 个门、个纲、个目、个科、个属 两组测序 和 统计表见表 表 健康组与腹泻组 和 组别序列数()/条分类操作单元()健康组().腹泻组().值.注:和 以均值 标准差表示以独立样本 检验评估组间差异.稀释性曲线()可以用来比较测序样品中物种的丰富度也可以说明测序的样本量是否足够覆盖所有类群 通过样品稀释性曲线图分析(图)发现腹泻组样本的丰富度整体低于健康组且随着样本量的增加曲线逐渐趋于平坦新 增加量逐渐减少 该结果表明本研究测序数据量充足可以覆盖样本中所有细菌类群图 健康组()及腹泻组梅花鹿()粪样稀释性曲线.()()微 生 物 学 杂 志 卷.样品复杂度分析.样品多样性分析等级丰度曲线()主要用来展示样本的多样性解释了样品所含物种的丰富度和均匀度两个方面 物种的丰富度由曲线宽度反映曲线在横轴上的范围越宽物种的丰富度越高物种均匀度由曲线形状反映曲线形状越平缓物种分布越均匀 由等级丰度曲线图(图)可知腹泻组较于健康组其菌群丰富度和均匀度有一定程度的下降图 健康组()及腹泻组梅花鹿()粪样等级丰度曲线.()().多样性分析 多样性()反映的是单个样品物种丰度及物种多样性有多种衡量指标 其中 和 指数反映样品物种丰度 和 指数反映物种多样性 这些指数表明本次测序结果代表了样本中微生物的真实情况 分析结果(表)表明健康组 多样性指数均高于腹泻组 和 指数表明健康组粪便菌群丰度显著高于腹泻组(.)指数表明健康组粪便菌群多样性显著高于腹泻组(.)表 健康组与腹泻组样本 多样性指数 指数健康组腹泻组 值.注:指数以均值 标准差表示独立样本 检验评估组间差异 的包括螺旋体门 期 吴家慧等:冬末春初圈养梅花鹿健康与腹泻个体粪便菌群的比较分析 ()、柔壁菌门()和疣微菌门()在健康组和腹泻组中分别占比.、.、.和.、.、.图 健康组()及腹泻组梅花鹿()肠道菌群 多样性分析.()():基于加权 算法的 分析:基于加权 算法的相似性分析:图 健康组()及腹泻组梅花鹿()肠道菌群组成在门水平上的对比图.细菌群落科水平组成健康及腹泻梅花鹿肠道菌群在科水平上的组成见图 在科水平上健康组优势菌科为瘤胃菌科()和 理 研 菌 科()相 对 丰 度 为 和.腹泻组优势菌科为瘤胃菌科和螺旋体科()相对丰度为.和.此外腹泻组中瘤胃球菌科、理研菌科、毛螺菌科()、普雷沃氏菌科()、克 里 斯 滕 森 菌 科()、丰度较健康组均 微 生 物 学 杂 志 卷有所下降而螺旋体科、拟杆菌科()、阿克曼氏菌科()和 丰度有所增加图 健康组()及腹泻组梅花鹿()肠道菌群组成在科水平上的对比图.()().细菌群落属水平组成 健康及腹泻梅花鹿肠道菌群在属水平上的组成见图 在属水平上瘤胃菌科 ()和 为腹泻组优势菌属相对丰度为.和.健康组优势菌属为瘤胃菌科 和克里斯滕森菌科 ()相对丰度为.和.此外腹泻组中瘤胃菌科、克里斯滕森菌科、理研菌科 ()、瘤胃菌科()、瘤胃菌科 ()、的丰度较健康组有所降低而 和拟杆菌属()的丰度较健康组有所上升.菌群差异分析.分析 通过 方法分析组间不同分类水平上具有显著性差异的菌群 在门水平上腹泻组疣微菌门高于健康组差异极显著(.)而柔壁菌门低于健康组差异极显著(.)在科水平上腹泻组阿克曼氏菌科极显著高于健康组(.)菌科显著高于健康组(.)而 显著低于健康组(.)在属水平上健康组理研菌科 和 显著高于腹泻组(.)瘤胃球菌科 和 极显著高于腹泻组(.)腹泻组阿克曼氏菌属()极显著高于健康组(.)显著高于健康组(.):(.)微 生 物 学 杂 志 卷 讨 论本研究采用 基因测序技术比较健康及腹泻梅花鹿粪便菌群获得的稀释性曲线趋近平坦且测序覆盖度()均超过说明本研究的测序数据能够体现样本中的绝大部分物种 多样性和 多样性分析结果表明腹泻组和健康组菌群组成存在显著差异且腹泻组菌群相对丰度和多样性均显著低于健康组符合腹泻组肠道菌群结构趋于简单的结论这 与 林 麝()、仔 猪()、小鼠()等研究结果一致 研究表明健康个体的肠道菌群相对丰度和多样性较高其肠道微生态系统具有一定的稳定性和恢复性可维持肠道菌群的动态平衡保障肠道的正常生理功能 而腹泻组肠道菌群相对丰度和多样性的降低说明其动态平衡已遭到破坏这可能是导致腹泻的原因实验梅花鹿无论是否腹泻厚壁菌门和拟杆菌门均为粪便菌群中的优势菌这与 等在北海道野生梅花鹿和田鑫等在野生及圈养梅花鹿上的研究一致 厚壁菌门与拟杆菌门参与纤维素分解产生短链脂肪酸和肠道免疫调节其中厚壁菌门与拟杆菌门的比值(/)的平衡对维持正常肠道内环境稳定及肠道健康有重要影响该比值的增加或降低被认为是菌群失调 后者通常被认为与炎症性肠病有关 腹泻组/比值低于健康组意味着腹泻组肠道内环境失衡菌群失调 在科水平上瘤胃菌科隶属厚壁菌门是健康组及腹泻组的优势菌科功能为分解纤维素 理研菌科是健康组次优势菌科具有肠道保护功能属于有益菌而腹泻组的理研菌科丰度下降螺旋体科丰度上升为次优势菌科 螺旋体科属于螺旋体门多为致病菌或条件致病菌如短螺旋体属可感染多种哺乳动物诱导产生结肠炎发生腹泻 在属水平上瘤胃菌科 是健康组和腹泻组的优势菌属 克里斯滕森菌科 是健康组的次优势菌属属于克里斯滕森菌科被认为是健康肠道特征的五个分类群之一可产生丁酸 丁酸不仅是结肠上皮细胞的主要能量来源还具有抗炎特性能下调促炎细胞因子改善结肠黏膜屏障功能 有研究表明在肠道快速运动及炎症状态下克里斯滕森菌科丰度逐渐下降 这与腹泻梅花鹿肠道中克里斯滕森菌科 丰度下降的结果一致 在腹泻组丰度增加属于螺旋体门 有研究显示 可能在肠道通透性中发挥一定作用进而影响肠道屏障和肠道炎症 可见腹泻组肠道菌群稳态失衡有益菌丰度下降有害菌或条件致病菌丰度上升这将进一步加剧肠道炎症从而形成恶性循环 分析表明腹泻与健康梅花鹿粪便菌群的丰度存在显著差异但前者粪便并未发现丰度显著变化的大肠埃希菌()或志贺氏菌()等常见致病菌这与大多数腹泻研究结果相异 因此推测本研究的腹泻梅花鹿可能是菌群紊乱导致的生理性腹泻 同时腹泻梅花鹿疣微菌门的相对丰度显著增加这与唐磊对腹泻仔猪研究结果一致 肠道疣微菌门可降解黏蛋白而黏蛋白是肠道粘液行使限制细菌穿透 保护上皮细胞功能的主要成分 黏蛋白含量的降低导致肠道屏障功能下降进而增大了病原微生物入侵的可能性这意味着疣微菌门可能推动了腹泻进程的发展 此外健康组瘤胃球菌科 和理研菌科 显著高于腹泻组而拟普雷沃氏菌属、阿克曼氏菌属显著低于腹泻组 其中瘤胃球菌属是主要的纤维素降解菌可降解纤维物质产生乙酸 瘤胃球菌科 可能参与挥发性脂肪酸代谢为机体提供能量 理研菌科 属于理研菌科通常发酵碳水化合物或蛋白质参与机体能量代谢 这表明健康组的纤维消化率和能量利用率高于腹泻组腹泻导致机体消化功能下降腹泻时拟普雷沃氏菌属丰度增加这与前人对仔猪的研究一致 有研究显示拟普雷沃氏菌属的某些菌株能够产生适量的醋酸和大量的琥珀酸作为发酵最终产物 这些短链脂肪酸被认为是维持肠道内稳态的关键 腹泻状态下拟普雷沃氏菌属丰度增加似乎是为维持肠道菌群平衡和调节肠道生理活动以防止其他细菌丰度减少进一步损害肠道 阿克曼氏菌属属于疣微菌门可降解黏蛋白是肠腔与黏膜间的关键菌群推测其丰度变化可能与黏蛋白含量相关且该菌可激活调节性 细胞和杯状细胞维持机体免疫 期 吴家慧等:冬末春初圈养梅花鹿健康与腹泻个体粪便菌群的比较分析 稳态和促进黏液产生 因此我们推测肠道免疫反应被激活杯状细胞分泌大量粘液促使阿克曼氏菌丰度增加 随着黏蛋白的大量消耗势必导致黏液层变薄肠道屏障功能减弱 这点在前人研究中有所证实小鼠体内阿克曼氏菌在其他菌群和碳水化合物耗尽后大量繁殖导致远端结肠黏液层变薄 这种过度的黏蛋白降解不仅会产生有毒代谢物(尤其是氨、酚、吲哚、胺、硫化物和 亚硝基化合物)还会促进机会性病原体和促炎性细菌的大量繁殖很可能导致肠炎类疾病 若不及时加以干预个体的生理性腹泻将会向病理性腹泻转变加剧肠道内环境失衡值得注意的是本研究在采样时正处于冬春之交气候变化剧烈的时期每日昼夜温差可达 以上 推测尽管此时环境菌群尚不活跃较大的气温变化可能影响饮水和多汁精料的温度在不考虑病毒和寄生虫的情况下可能引发梅花鹿肠道菌群失调进而导致生理性腹泻 鹿场技术人员也表示每年梅花鹿在这一时期腹泻频发因此认为每年的冬末春初时期需要关注鹿群的饮水和饲料的温度预防发生腹泻提高鹿场饲养管理水平保证鹿场的正常运作和健康发展 同时鹿场饲养员应注意在腹泻发生时不能盲目使用抗生素需要对症下药 对于这种生理性腹泻若盲目使用抗生素很可能进一步加剧菌群紊乱导致病情加重 有研究者表明使用益生菌等微生态制剂能够调整宿主菌群结构恢复肠道稳态改善肠道发育和健康 在之后的研究中可以进一步关注微生态制剂对于腹泻鹿只菌群的影响 本研究认为较大的昼夜温差可引发梅花鹿肠道菌群失调进而导致生理性腹泻同时腹泻梅花鹿肠道中疣微菌门及其门下的阿克曼氏菌属丰度的升高可能推动腹泻进程这可为鹿场提高梅花鹿饲养管理水平、防控腹泻提供参考 同时利用微生态制剂改善梅花鹿肠道菌群恢复菌群平衡可进行进一步的探讨和研究参考文献:曾德军吴忠宝赵贵军等.梅花鹿腹泻病的病因及防治对策.畜禽业():.黄海娇.梅花鹿腹泻治疗的误区及其对策.饲料博览():.():.:.():.():.张飞燕金洁刘超等.利用 测序平台分析健康与腹泻食蟹猴粪样菌群.野生动物学报():.():.():.任平夏天李平等.脾虚腹泻患者肠道菌群的研究.中医杂志():.张子敬朱肖亭吕世杰等.腹泻犊牛与健康犊牛粪便菌群结构组成与功能研究.中国畜牧兽医():.杨柠芝李婷王燕等.断奶前后非特异病原性腹泻羔羊生长生理及肠道菌群差异性比较.中国农业科学():.():.汪群闫鹤.腹泻仔猪与健康仔猪粪便菌群多样性的比较.中国畜牧杂志():.():.():.田鑫田来明贾赦等.野生和圈养梅花鹿肠道菌群的分析.黑龙江畜牧兽医():.():./.微 生 物 学 杂 志 卷():.高岩殷术鑫王璐等.饲喂酸化乳对犊牛粪便微生物多样性的影响.动物营养学报():.杨东吉张静静朱随亮等.酿酒酵母培养物替代抗生素对断奶仔猪生长性能、养分消化率及盲肠微生物区系的影响.动物营养学报():.:.():.():.():.():.唐磊.利用 测序技术分析腹泻仔猪肠道菌群结构特征及灌服粪肠球菌对其调节作用.南京:南京农业大学.().():.():.曾钰高彦华彭忠利等.饲粮中添加酵母培养物对舍饲牦牛瘤胃发酵参数及微生物区系的影响.动物营养学报():.():.徐莉刘影张江等.健康与腹泻梅山仔猪粪便微生物变化分析.饲料研究():.():.():.():.():.():.():.():.():.():.期 吴家慧等:冬末春初圈养梅花鹿健康与腹泻个体粪便菌群的比较分析