高中生物《DNA的粗提取与鉴定》学案3-新人教版必修1.doc

专题5 DNA和蛋白质技术课题1 DNA的粗提取与鉴定一、课题目标本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质，尤其是DNA的溶解性；理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理，二苯胺法鉴定DNA的方法和原理。二、课题重点和难点课题重点：DNA的粗提取和鉴定方法。课题难点：DNA的粗提取和鉴定方法。三、学习过程A、自主学习（一）、基础知识1DNA的溶解性：思考题1：DNA在氯化钠溶液中的溶解度有什么特点？对此有什么应用？ 思考题2：利用什么原理来将DNA与蛋白质分离开？2DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：蛋白酶能水解 ，但对 没有影响。大多数蛋白质不能忍受 的高温，而DNA在 以上才会变性。 能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。3细胞在 中易吸水而导致细胞膜和细胞核膜的破裂，据此可得到含有核DNA的溶液。4DNA的鉴定：思考题3：依据什么原理来鉴定DNA？三、实验材料：鸡血细胞液思考题4：生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，他们能否选用牛、羊、马血做实验材料？为什么？ 四、实验步骤：1制备鸡血细胞液：在鸡血中加入质量浓度为01g/mL的 溶液，离心处理；2提取鸡血细胞的细胞核物质：向鸡血细胞液中加入蒸馏水，搅拌、过滤；思考题5：加入蒸馏水的目的是什么？为什么能达到此目的？3溶解细胞核内的DNA：加入2mol/L的氯化钠溶液，搅拌，使DNA呈溶解状态；4析出含DNA的黏稠物：加入蒸馏水，用玻璃棒搅拌；思考题6：此时加入蒸馏水的目的是什么？ 5滤取含DNA的黏稠物：过滤；思考题7：这次过滤与上次过滤的目的一样吗？为什么？ 6将DNA的黏稠物再溶解：加入2mol/L的氯化钠溶液，搅拌，使DNA呈溶解状态；7过滤含有DNA的氯化钠溶液：过滤；思考题8：这一步骤的目的是什么？ 思考题9：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？8提取含杂质较少的DNA：加入冷却的95%的酒精，搅拌；思考题10：这一步骤的目的是什么？ 思考题11：为什么加入的酒精需要冷却的？ 9DNA的鉴定：取两支试管，各加入0015mol/L的氯化钠溶液5mL，一支加入提取的DNA，两支各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后置于沸水中加热。思考题12：为什么要设置对照组？实验中能观察到什么现象？ B重点、难点突破1实验原理 提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠浓度的变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。 DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 3实验步骤分析.破碎细胞，释放DNA鸡血细胞中的DNA与核蛋白结合，位于鸡血细胞的细胞核中，正常情况下是不会释放出来的。为了使DNA从细胞核中释放出来，需要向鸡血细胞液中加入蒸馏水，并且搅拌，从而使血细胞膜和核膜胀破。用玻璃棒搅拌可以加速细胞的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA。一般510 mL的鸡血细胞液加入20 mL蒸馏水搅拌5 min。释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应用34层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质。溶解细胞核内的DNA在浓度较高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚，游离出的DNA溶解在溶液中。在溶液中加入两倍体积的浓度为2 mol/L的NaCl溶液，搅拌1 min。注意应沿一个方向搅拌，使DNA充分溶解。DNA的析出将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。本案例选取方案一。加蒸馏水降低NaCl溶液浓度，使DNA析出。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕。同时应注意控制加水量，使NaCl溶液的终浓度为0.10.2 mol/L。加水过程一般分三次进行，当总加水量为300 mL左右时，DNA已基本析出。加水太多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。用34层纱布对DNA稀释液进行过滤，滤去蛋白质，收集DNA的黏稠物。如果采用离心法，效果更好。用4 000 r/min转速的离心机，离心15 min，除去上清液(含有蛋白质)，留下的沉淀物中含有DNA。此时注意观察DNA黏稠物的颜色。.DNA的初步纯化如果提取的DNA量不够多且其中含有较多杂质，或者加入溶液和搅拌等操作过程不规范，都会导致实验现象不明显，常常使制取的DNA粗制品不能显示出DNA的本色白色。为了增进实验效果，需要对DNA粗制品进行简单的提纯。3. 课题成果评价.是否提取出了DNA观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。.分析DNA中的杂质本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。.不同实验方法的比较对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。4. DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系：当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低；当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度升高。5. 制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入柠檬酸钠的原因制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入抗凝剂柠檬酸钠，防止血液凝固。其原理是柠檬酸钠能与血浆中Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液便不会凝固，因为鸡血红细胞，白细胞都有细胞核，DNA主要存在于细胞核中，所以在离心或静置沉淀后，要弃出上层清液血浆。6提取DNA的第一步是材料的选取其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。7盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的DNA的损失。8.答案和提示（一）旁栏思考题1为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。2加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。3如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。4此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。5为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。6方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。（二）练习1答：提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。2答：提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。【例l】 下图为“DNA的粗提取与鉴定”的实验示意图，其正确的操作顺序是 解析 DNA位于鸡血细胞的细胞核中。采用加蒸馏水并且搅拌的方法，可使鸡血细胞大量吸水胀破，细胞膜、核膜破坏，搅拌的机械作用更加速了细胞的破裂释放出的核物质其实是DNA、RNA和蛋白质的混合物。在浓度较高的氯化钠溶液中核蛋白质容易解聚，DNA的溶解度也很高，经过滤便分离出含少量杂质的DNA。根据DNA在冷却的95的酒精中凝集反应强烈的性质，进一步纯化DNA。将DNA溶解于较高浓度的氯化钠溶液中，加入冷却的95的酒精溶液，可使DNA沉淀、浓缩，形成含杂质较少的DNA丝状物。 答案 DC反馈矫正1在破碎血细胞时，要先加入20 mL的蒸馏水，其作用是ADNA溶解水中 B血细胞破裂，DNA释放 C稀释血液，防止凝固 D有利于搅拌2以血液为实验材料时，需要向血液中加入（ ），防止血液凝固。A醋酸钠 B龙胆紫 C柠檬酸钠 D醋酸洋红3用过滤的方法得到细胞中的氯化钠溶液后，还要用酒精处理，可以得到较纯化的DNA这是因为：ADNA易溶于酒精，而滤液中某些杂质不易溶于酒精BDNA不易溶于酒精，而滤液中某些杂质易溶于酒精CDNA和滤液中其他成分更易溶于酒精DDNA和滤液中其他成分都不溶于酒精4、DNA在下列浓度的NaCl溶液中，溶解度最低的是 A2molLB0.015molL C0.14molLD5molL5、与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是 A.操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度 B.在操作A时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整 C.加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出D.当丝状粘稠物不再增加时，此时NaCl的浓度相当于0.14mol/L6、洗涤剂能够瓦解 ，但对DNA没有影响。 A.细胞壁 B.细胞膜 C.细胞核 D.细胞质7、在向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是 A.加快溶解DNA的速度 B.加快溶解杂质的速度 C.减少DNA的溶解度，加快DNA析出 D.减小杂质的溶解度，加快杂质的析出8、去除滤液中的杂质时，直接在滤液中加入嫩肉粉，利用嫩肉粉中的 分解蛋白质。A. 胃蛋白酶 B. 胰蛋白酶 C. 木瓜蛋白酶 D. 肠肽酶9DNA 不溶解于A. NaCl溶液 B. KCl溶液 C. C2H5OH D. MgCl2溶液10（多选）下表是关于DNA粗提取与鉴定实验中所使用的材料、操作及其作用的表述正确的是： 试剂操作作用A柠檬酸钠溶液与鸡血混合防止血液凝固B蒸馏水与鸡血细胞混合保持细胞形状C蒸馏水加入到溶解有DNA的NaCl中析出DNA丝状物D冷却的酒精加入到过滤后DNA的NaCl中产生特定的颜色反应11在进行DNA粗提取实验时，为得到含DNA的黏稠物，某同学进行了如下操作： 在新鲜鸡血中加入适量的柠檬酸，经离心后，除去血浆留下血细胞备用。 取510ml血细胞放入50ml的塑料烧杯中，并立即注入20ml 0.015molL的氯化钠溶液，快速搅拌5分钟后经滤纸过滤，取得其滤液。 滤液中加入40ml 2molL的氯化钠溶液，并用玻璃棒沿一个方向快速搅拌1分钟。 上述溶液中缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，直到溶液中出现丝状物为止，再进行过滤而得到含DNA的黏稠物。实验结果是：所得到的含DNA的黏稠物极少，导致下一步试验无法进行。（1）指出并改正上述实验操作中的错误： ， ， 。 (2) 要进一步提取DNA时，需加入冷却的酒精，其作用是 和。12在DNA粗提取与鉴定的实验中，选择适当浓度的NaCl溶液就能充分溶解DNA而使杂质沉淀，或析出DNA过滤去除溶液中的可溶性杂质。请在右图中作出DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线。13、DNA的粗提取与鉴定的实验(如下图)： (1) 本实验材料选用鸡血细胞液而不是用鸡的全血，主要原因是由于鸡血细胞液中含有较高含量的_。(2) 图A中加入蒸馏水的目的是_。(3) 通过图B所示步骤取得滤液后，再向滤液中加入2 molLNaCl溶液的目的是_。(4) 图C所示加入蒸馏水的目的是_。(5) 为鉴定实验所得丝状物的主要成分是DNA，可用_试剂进行检验，颜色反应为_色。14、关于DNA粗提取的实验材料的选择，也经过了多次实验效果的比较，最终选择鸡血做实验材料的原因是什么？请回答下列问题： 鸡血细胞中红细胞 ，家鸡属于鸟类，新陈代谢旺盛，因而血液中 细胞数目较多，可以提供丰富的 。 生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，若他们按实验要求完成实验步骤后，结果是提取的DNA很少或提取不到，这是因为这些动物和人一样，成熟的红细胞中 ，但若改用动物肝脏做实验材料，实验能顺利进行。这是因为 。 若选用动物肝脏做实验材料，在提取之前，最好增加 程序，使组织细胞更易分离。15、填写本实验完成下列实验操作时所用试剂。 提取鸡血细胞中核物质 溶解核内DNA： 析出2mol/LNaCl溶液中的DNA 提取杂质较少的DNA白色乳状丝状物 DNA的鉴定 附：课题3 酵母细胞的固定化的参考答案A、自主学习（一）、基础知识1、能否有一种方法使酶发挥它的优点，而没有这些缺点？ 酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。 细胞中有多种酶，能否用固定化酶类似的技术来处理细胞？ 成本低，操作更容易2、果糖含量为42%的糖浆 葡萄糖异构酶 颗粒状的载体上 筛板 葡萄糖异构酶 3、 物理 化学 包埋 化学结合法 物理吸附法 化学结合法、 物理吸附法 包埋法 化学结合 吸附 包埋料 均匀 多孔性载体 明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等思考1 吸附法 思考2 细胞 ； 酶4、干酵母 CaCl2 海藻酸钠溶液 休眠 微火加热并不断搅拌，防止海藻酸钠焦糊 CaCl2 30分钟 蒸馏水 25 24h。思考3 防止海藻酸钠焦糊 思考4 防止高温杀死酵母细胞 思考5 酵母菌的酒精发酵需要缺氧条件 思考6 酵母菌进行无氧呼吸产生的。 思考7 需要。5、气泡 酒味C反馈矫正1A 2C 3.C 4D 5C 6C 7、C 8.D 9.A 10A 11、B 12.D 13.B 14.A15D 16D 17D 18A 19.C 20C 21、（1）反应柱； 固定化酶； 分布着小孔的筛板 （2）既能与反应物接触，又能与反应物分离； 能被反复利用； 成本更低，操作更容易 （3）酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由出入。（4）将酶相互连接起来；将酶吸附在载体表面上 （5）反应物溶液从反应柱上端注入，使反应物溶液流过反应柱，与固定化酶接触，得到产物，从反应柱下端流出。22、（1）缺水； 正常生活状态； 体积增大（2）配制海藻酸钠溶液； (3)少 （4）固定化酵母细胞数目较少； 海藻酸钠浓度偏高，制作失败（5）因为酶分子很小，容易从包埋材料中漏出附：课题1 DNA的粗提取与鉴定的参考答案A、自主学习（一）、基础知识思考题1、DNA在氯化钠溶液中的溶解度，随着氯化钠的浓度的变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出；思考题2、DNA不溶于酒精，但细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步地分离。2 蛋白质 DNA 60-80 80 洗涤剂 3 蒸馏水思考题3、DNA遇二苯胺（沸水浴）被染成蓝色，所以可用二苯胺作鉴定。思考题4、不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核，仅靠白细胞和淋巴细胞中的少数DNA，在实验中很难提取到。 柠檬酸钠思考题5、加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA；蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂。思考题6、使氯化钠溶液浓度接近014mol/L，使DNA最大限度地析出。思考题7、不一样；这次过滤是为了去除溶于氯化钠溶液的杂质，而上次过滤是为了去除破裂的细胞膜等物质。思考题8、除去含有DNA滤液中的杂质；思考题9、用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。思考题10、去除溶于酒精的杂质；思考题11、可抑制核酸水解酶的活性，防止降解DNA；降低分子的运动，易于形成沉淀析出；低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。思考题12、确定二苯胺不与氯化钠发生颜色反应；实验组试管中可看到溶液变蓝色。C反馈矫正：1B 2C 3B 4、C 5、C 6、B 7、C 8、C 9C 10AC11（1）中“20ml 0.015molL的氯化钠溶液”错误，应改为“20ml蒸馏水”中“经滤纸过滤”错误，应改为“经纱布过滤” 中“直到溶液中出现丝状物为止”错误，应改为“直到溶液中丝状物不再增加时为止”（2）凝集DNA 溶解其他细胞物质 1213、（1）DNA （2）使血细胞吸水涨破，释放出核物质DNA（3）使DNA溶解于NaCl溶液中（4）使DNA的溶解度下降而析出 （5）二苯胺 蓝色14、 含细胞核；红；DNA 无细胞核；肝细胞有细胞核 研磨15、蒸馏水2mol/LNaCl溶液蒸馏水冷却的95%的酒精二苯胺附：课题1 DNA的粗提取与鉴定的参考答案A、自主学习（一）、基础知识思考题1、DNA在氯化钠溶液中的溶解度，随着氯化钠的浓度的变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出；思考题2、DNA不溶于酒精，但细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步地分离。2 蛋白质 DNA 60-80 80 洗涤剂 3 蒸馏水思考题3、DNA遇二苯胺（沸水浴）被染成蓝色，所以可用二苯胺作鉴定。思考题4、不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核，仅靠白细胞和淋巴细胞中的少数DNA，在实验中很难提取到。 柠檬酸钠思考题5、加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA；蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂。思考题6、使氯化钠溶液浓度接近014mol/L，使DNA最大限度地析出。思考题7、不一样；这次过滤是为了去除溶于氯化钠溶液的杂质，而上次过滤是为了去除破裂的细胞膜等物质。思考题8、除去含有DNA滤液中的杂质；思考题9、用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。思考题10、去除溶于酒精的杂质；思考题11、可抑制核酸水解酶的活性，防止降解DNA；降低分子的运动，易于形成沉淀析出；低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。思考题12、确定二苯胺不与氯化钠发生颜色反应；实验组试管中可看到溶液变蓝色。C反馈矫正：1B 2C 3B 4、C 5、C 6、B 7、C 8、C 9C 10AC11（1）中“20ml 0.015molL的氯化钠溶液”错误，应改为“20ml蒸馏水”中“经滤纸过滤”错误，应改为“经纱布过滤” 中“直到溶液中出现丝状物为止”错误，应改为“直到溶液中丝状物不再增加时为止”（2）凝集DNA 溶解其他细胞物质 1213、（1）DNA （2）使血细胞吸水涨破，释放出核物质DNA（3）使DNA溶解于NaCl溶液中（4）使DNA的溶解度下降而析出 （5）二苯胺 蓝色14、 含细胞核；红；DNA 无细胞核；肝细胞有细胞核 研磨15、蒸馏水2mol/LNaCl溶液蒸馏水冷却的95%的酒精二苯胺10用心 爱心 专心