二甲双胍改善由C9ORF72肌萎缩侧索硬化_额颞叶痴呆相关多聚甘氨酸-精氨酸诱导的线粒体损伤.pdf

Vol.43 No.7 Jul.2023上海交通大学学报（医学版）JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（7）二甲双胍改善由C9ORF72肌萎缩侧索硬化/额颞叶痴呆相关多聚甘氨酸-精氨酸诱导的线粒体损伤冯奕源1，徐忠匀1，尹雅芙1，王辉1，程维维1，21.上海交通大学医学院附属新华医院核医学科，上海 200092；2.上海交通大学医学院附属新华医院心血管发育与再生医学研究所，上海 200092摘要目的探索C9ORF72肌萎缩侧索硬化/额颞叶痴呆（amyotrophic lateral sclerosis/frontotemporal dementia，ALS/FTD）相关的多聚甘氨酸-精氨酸（poly-glycine-arginine，poly-GR）对线粒体形态及功能的影响，并分析二甲双胍对由poly-GR诱导的线粒体损伤的修复作用及其可能的机制。方法采用慢病毒感染法分别构建能够稳定表达50个重复甘氨酸-精氨酸序列（glycine-arginine）50，（GR）50 和绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的SK-N-SH细胞，即（GR）50-SK细胞株和GFP CTRL-SK细胞株。采用蛋白质印迹法（Western blotting）验证已构建细胞中（GR）50蛋白的表达水平，并采用荧光显微镜观察GFP CTRL-SK细胞的GFP表达。采用碘化丙啶（propidium iodine，PI）染色分别检测（GR）50-SK、GFP CTRL-SK细胞的凋亡水平。利用免疫荧光（immunofluorescence，IF）染色分析（GR）50蛋白在细胞内的定位情况。采用超氧化物指示剂MitoSOX Red分别对（GR）50-SK、GFP CTRL-SK细胞的氧自由基进行染色，并利用荧光显微镜观察红色荧光强度以评估线粒体活性氧水平的变化。采用透射电镜分别观察（GR）50-SK、GFP CTRL-SK细胞的线粒体形态。采用Western blotting检测（GR）50-SK、GFP CTRL-SK细胞的蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）及其磷酸化水平。利用SC79激活（GR）50-SK细胞中的AKT，并采用MitoSOX Red染色及PI染色实验分析AKT磷酸化后细胞的线粒体活性氧水平及凋亡水平。利用二甲双胍处理（GR）50-SK、GFP CTRL-SK细胞，随后通过上述方法以及ATP检测试剂盒检测细胞的凋亡水平、线粒体活性氧水平、线粒体形态、AKT及其磷酸化水平、ATP浓度情况。结果Western blotting结果提示（GR）50-SK细胞构建成功，荧光显微镜的观察结果显示GFP CTRL-SK细胞构建成功。PI染色结果显示，（GR）50-SK细胞较GFP CTRL-SK细胞的凋亡水平更高（P=0.016）。IF结果提示，（GR）50-SK细胞中（GR）50蛋白与线粒体存在部分共定位。与GFP CTRL-SK细胞相比，（GR）50-SK细胞的线粒体形态及结构存在明显异常，其活性氧水平明显上升。（GR）50-SK细胞中的AKT水平与GFP CTRL-SK细胞相仿，但磷酸化AKT水平显著下降。SC79处理（GR）50-SK细胞后，可显著上调其AKT磷酸化水平，并下调其活性氧水平及凋亡水平。二甲双胍处理可明显上调（GR）50-SK细胞中的磷酸化AKT水平，但对AKT水平无影响；可重塑该细胞中的部分线粒体形态结构、降低活性氧水平、增加ATP的生成（P=0.000），并下调细胞的凋亡水平（P=0.000）。结论（GR）50可通过下调AKT磷酸化引起线粒体形态及功能异常，并促进细胞凋亡；而二甲双胍则可抑制由（GR）50蛋白诱导的上述病理事件的发生。关键词C9ORF72肌萎缩侧索硬化症/额颞叶痴呆；多聚甘氨酸-精氨酸；线粒体；磷酸化蛋白激酶B；二甲双胍DOI10.3969/j.issn.1674-8115.2023.07.006 中图分类号R744.8 文献标志码AMetformin ameliorates the mitochondrial damage induced by C9ORF72 amyotrophic lateral sclerosis/frontotemporal dementia-related poly-GRFENG Yiyuan1,XU Zhongyun1,YIN Yafu1,WANG Hui1,CHENG Weiwei1,21.Department of Nuclear Medicine,Xinhua Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200092,China;2.Institute for Developmental and Regenerative Cardiovascular Medicine,Xinhua Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200092,China论著 基础研究基金项目 国家自然科学基金（81901162）；上海市青年科技启明星计划（20QA1406300）。作者简介 冯奕源（1997），女，硕士生；电子信箱：。通信作者 程维维，电子信箱：。Funding Information National Natural Science Foundation of China(81901162);Shanghai Rising-Star Program(20QA1406300).Corresponding Author CHENG Weiwei,E-mail:.8392023,43（7）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.7 Jul.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)Abstract Objective To investigate the effect of C9ORF72 amyotrophic lateral sclerosis/frontotemporal dementia(ALS/FTD)-related poly-glycine-arginine(poly-GR)on mitochondrial morphology and function,and analyze the rescue effect of metformin on mitochondrial damage induced by poly-GR and its underlying mechanism.Methods SK-N-SH cells stably overexpressing 50 repeated glycine-arginine sequences(GR)50 or green fluorescent protein(GFP)were constructed by lentivirus infection,which were respectively named as(GR)50-SK cell line and GFP CTRL-SK cell line.(GR)50 expression in(GR)50-SK cells was verified by Western blotting.GFP expression in GFP GTRL-SK cells was observed by fluorescence microscope.Propidium iodide(PI)staining was used to detect the apoptosis levels of(GR)50-SK and GFP CTRL-SK cells.Immunofluorescence(IF)staining was performed to determine the subcellular location of(GR)50.Reactive oxygen species(ROS)level of mitochondria was evaluated by staining cells with MitoSOX Red followed by observing the intensity of red fluorescence under fluorescence microscope.The mitochondrial morphology of(GR)50-SK and GFP CTRL-SK cells was observed by transmission electron microscopy.Western blotting was used to detect protein kinase B(PKB,also known as AKT)and its phosphorylation levels in(GR)50-SK and GFP CTRL-SK cells.SC79 was used to activate AKT in(GR)50-SK cells,and MitoSOX Red staining and PI staining were used to analyze mitochondrial ROS and apoptosis levels after phosphorylated AKT increased.Metformin was used to treat(GR)50-SK and GFP CTRL-SK cells,respectively,and the apoptosis levels,mitochondrial ROS levels,mitochondrial morphology,AKT and its phosphorylation levels,and ATP concentrations of the two cells were detected by the above methods and ATP detection kit,respectively.Results Western blotting showed that the construction of(GR)50-SK cells was successful,and fluorescence microscopy showed that the construction of GFP CTRL-SK cells was also successful.PI staining results showed that the apoptosis level of(GR)50-SK cells was higher than that of the GFP CTRL-SK cells(P=0.016).IF staining results showed that there was partial co-localization of(GR)50 in the mitochondria of(GR)50-SK cells.Compared with GFP CTRL-SK cells,the mitochondrial morphology and structure of(GR)50-SK cells were significant abnormalities,with a significantly increased ROS levels.The AKT levels in(GR)50-SK cells were similar to those in the GFP CTRL-SK cells,but there was a significant decrease in phosphorylated AKT levels.After(GR)50-SK cells were treated with SC79,the AKT phosphorylation level was significantly upregulated,and ROS level and apoptosis level were significantly downregulated.Metformin could significantly up-regulate the phosphorylated AKT levels in(GR)50-SK cells,but had no effect on AKT levels;it could reshape the morphology and structure of some mitochondria,reduce ROS levels,increase ATP production(P=0.000),and down-regulate the level of cell apoptosis(P=0.000).Conclusion(GR)50 can cause mitochondrial morphology and function abnormalities by down-regulating AKT phosphorylation,and promote cell apoptosis.Metformin can effectively reduce the occurrence of the above pathological events induced by(GR)50.Key words C9ORF72 amyotrophic lateral sclerosis/frontotemporal dementia(C9ORF72 ALS/FTD);poly-glycine-arginine(poly-GR);mitochondrion;phosphorylated protein kinase B;metforminC9ORF72基因1号内含子区GGGGCC重复序列GGGGCC repeat，（G4C2）n 的扩增突变是导致遗传性肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）和 额 颞 叶 痴 呆（frontotemporal dementia，FTD）发生的最常见病因1。异常扩增的（G4C2）n可 通 过 由 重 复 序 列 介 导 的 不 依 赖 AUG（repeat associated non-AUG，RAN）翻译产生 5 种聚二肽重复蛋白（dipeptide repeat protein，DPR），其中以多聚甘氨酸-精氨酸（poly-glycine-arginine，poly-GR）的细胞毒性最为显著2-3。有尸检结果4发现，poly-GR 主要分布在皮层、海马及小脑区域，其在脑内的分布很大程度上与 C9ORF72 ALS/FTD 患者疾病累及的脑区重叠；继而提示较其他的 DPR，poly-GR 与 C9ORF72 ALS/FTD 患者的神经元损伤关系更为密切。相关研究2，5-6已证实，poly-GR可通过引起 DNA 损伤、翻译抑制及线粒体功能障碍等造成神经元死亡，其中线粒体功能障碍被认为是poly-GR 导致神经元死亡的早期病理事件之一。因此，有效降低 poly-GR 水平、减轻 poly-GR 对线粒体 功 能 的 损 伤 是 降 低 poly-GR 细 胞 毒 性 的 重 要手段。已有研究7证实蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又称 AKT）对 poly-GR 毒性具有重要调控作用，过表达AKT或利用AKT激动剂SC79促进AKT的磷酸化均可有效降低poly-GR水平及其细胞毒性。而 poly-GR 过表达是否会引起 AKT及其磷酸化水平的异常，该异常与 poly-GR 导致线粒体功能障碍的相关性如何，目前则鲜少有报道，进而也缺乏以AKT 或线粒体为靶点来抑制 poly-GR 相关毒性的应用尝试。临床上，二甲双胍是治疗糖尿病的一线用药，其已被证实可有效恢复神经退行性疾病模型中的线粒体功能障碍；且有研究提示，二甲双胍也可促进AKT磷酸化8。基于此，本研究就poly-GR过表达对线粒体功能、AKT及其磷酸化水平的影响进行分析，并就二甲双胍对由 poly-GR 诱导的线粒体功能异常及细胞凋亡的影响进行探讨，以期为缓解poly-GR 细胞毒性、延缓 C9ORF72 ALS/FTD 进展提供有效的策略。840冯奕源，等二甲双胍改善由C9ORF72 肌萎缩侧索硬化/额颞叶痴呆相关多聚甘氨酸-精氨酸诱导的线粒体损伤http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（7）1材料与方法1.1细胞、试剂与仪器人胚肾细胞 293T、人神经母细胞瘤细胞 SK-N-SH均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。MitoSOX Red 线 粒 体 超 氧 化 物 指 示 剂（Invitrogen，美国），碘化丙啶（propidium iodide，PI；上海懋康生物科技有限公司），In-Fusion试剂盒（TaKaRa，日本），二甲双胍（上海碧云天生物科技有限公司），AKT 激动剂 SC79（MedChemExpress，美国），FLAG 抗体（Sigma，德国），-actin 抗体、磷酸化 AKT（T308）抗体、AKT 抗体、GAPDH 抗体、线 粒 体 外 膜 转 位 酶 20（translocase of outer mitochondrial membrane 20，TOM20）、热激蛋白 90（heat shock protein 90，HSP90）抗体（Cell Signaling Technology，美国），辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标 记 的 羊 抗 鼠 或 羊 抗 兔 IgG、Alexa Fluro 488 或 555 荧光标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG（Thermo Fisher Scientific，美国），ATP检测试剂盒（Caymen，美国）。共聚焦显微镜（ZEISS，德国），倒置相差荧光显微镜（Nikon，日本），化学发光仪（上海勤翔科学仪器有限公司），透射电子显微镜（Hitachi，日 本），多 功 能 酶 标 仪（BioTek，美国）。1.2实验方法1.2.1细胞培养于37、5%CO2的恒温培养箱中，用含 10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素及 100 mg/mL链霉素的 DMEM 高糖完全培养基分别培养 293T、SK-N-SH细胞。每隔23 d传代1次，取对数生长期的细胞用于后续实验。1.2.2慢病毒质粒构建利用 PCR 分别扩增含有Age和 BamH酶切位点的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）、50个重复甘氨酸-精氨酸序列（glycine-arginine）50，（GR）50 优化密码子的核酸片段 其中（GR）50片段C端带有FLAG标签蛋白序列，随后经琼脂糖凝胶电泳纯化、回收。利用Age和BamH限制性内切酶线性化慢病毒载体质粒lentiCas9-Blast，而后采用 In-Fusion 试剂盒分别将上述回收的2种核酸片段插入线性化载体中，以构建过表达GFP、（GR）50的慢病毒质粒即lenti-GFP及lenti-（GR）50。1.2.3慢病毒包装根据慢病毒包装试剂说明书，将慢病毒质粒lenti-GFP或lenti-（GR）50配置成质粒-转染试剂混合液，室温静置15 min后均匀滴加至培养皿中。于转染后72 h，利用0.45 m过滤器收集慢病毒上清液，立即使用或存放于80 备用。1.2.4稳转株的构建及验证将SK-N-SH细胞（5105/mL）接种于6孔板中，分别加入由“1.2.3”部分收集到的2种慢病毒上清液，于37、5%CO2恒温培养箱中培养24 h后，更换为DMEM高糖完全培养基，并向其中添加3 g/mL嘌呤霉素进行筛选，以获得稳定过表达 GFP、（GR）50的细胞 即 GFP CTRL-SK、（GR）50-SK细胞。采用荧光显微镜观察GFP CTRL-SK细胞内GFP的表达情况。采用蛋白质印迹法（Western blotting）对上述构建的稳定过表达细胞进行验证。向上述2种细胞中加入蛋白裂解液，而后于4 下14 000g离心 10 min，取上清液行蛋白浓度测定，再通过Western blotting 检测（GR）50的 C 末端 FLAG 标签蛋白的表达以分析（GR）50的过表达效率，并以此验证（GR）50-SK 细胞的构建是否成功；其中，一抗为-actin、FLAG 抗体（稀释比例均为 1 1 000），二 抗 为 HRP 标 记 的 羊 抗 鼠 IgG（稀 释 比 例 为1 5 000）。1.2.5 细 胞 凋 亡 水 平 检 测 于 24 孔 板 培 养 GFP CTRL-SK、（GR）50-SK 细 胞，向 其 中 分 别 添 加1 mol/L PI，37 孵育30 min后，于共聚焦显微镜下观察并统计PI染色阳性细胞数量（即凋亡细胞数量）。每种细胞设置5个复孔，每孔取4个视野。1.2.6（GR）50蛋白的亚细胞定位分析采用免疫荧光（immunofluorescence，IF）染色研究（GR）50蛋白在细胞内的定位情况。分别将（GR）50-SK、GFP CTRL-SK 细胞以 30%40%密度铺种于小圆玻璃片上，利用含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）于室温下固定细胞，并对其行透化、封闭等处理。采用一抗、二抗孵育后，行DAPI细胞核染色；其中，一抗为FLAG抗体（稀释比例为1 300）、TOM20抗体及HSP90抗体（稀释比例均为1 200），二抗为Alexa Fluro 488或555荧光标记羊抗鼠 IgG、羊抗兔 IgG（稀释比例均为 1 500）。于共聚焦显微镜下观察荧光信号分布，以明确（GR）50蛋白在细胞内的定位情况。1.2.7 线 粒 体 活 性 氧 水 平 检 测 将 2.5 mol/L 8412023,43（7）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.7 Jul.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)MitoSOX Red 分 别 加 入 培 养 的（GR）50-SK、GFP CTRL-SK细胞中，37 孵育30 min后用Hank s平衡液漂洗3次，于共聚焦显微镜下观察红色荧光强度，以 评 估 细 胞 内 的 线 粒 体 活 性 氧（reactive oxygen species，ROS）水平。1.2.8线粒体形态学分析分别将（GR）50-SK、GFP CTRL-SK 细胞铺于 10 cm 培养皿中，待细胞生长融合达70%80%后，通过胰蛋白酶消化及低速离心，收集绿豆大小的细胞团。向其中加入电镜固定液，于4 固定5 min，经PBS漂洗2次后用0.1 mol/L PBS配制的1%锇酸于室温下避光固定2 h，再经PBS漂洗、室温脱水、包埋后采用超薄切片机进行处理，于醋酸锂染色后在透射电子显微镜下观察线粒体形态，并对其形态进行定量分析（包括正常线粒体的百分比统计、线粒体短径测量）。1.2.9AKT及其磷酸化水平的检测将（GR）50-SK、GFP CTRL-SK 细胞以 30%40%密度接种于 6 孔板中，按“1.2.4”部分中的步骤进行裂解、离心制备蛋白上清液，并采用Western blotting检测细胞中的AKT及 其 磷 酸 化 水 平；其 中，一 抗 为 磷 酸 化 AKT（T308）、AKT 及 GAPDH 抗体（稀释比例均为 1 1 000），二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG（稀释比例均为1 5 000）。1.2.10SC79 处理对（GR）50-SK 细胞磷酸化 AKT、凋亡及线粒体 ROS 水平的影响使用 2 mol/L 的AKT激活剂SC79处理（GR）50-SK细胞，并设置二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）处理为空白对照组。按照“1.2.9”部分中的步骤制备蛋白上清液并检测AKT及其磷酸化水平。而后，按照“1.2.5”及“1.2.7”部分中的步骤，检测 SC79 对（GR）50-SK 细胞的凋亡水平、线粒体ROS水平的影响。1.2.11二甲双胍处理对细胞的磷酸化AKT、线粒体形态、ROS 水平及细胞凋亡水平的影响采用0.2 mmol/L 二 甲 双 胍 分 别 处 理（GR）50-SK、GFP CTRL-SK 细胞 72 h，设置 PBS 处理为对照，共计 4组。药物处理结束后，按照“1.2.9”部分中的步骤检测 4 组细胞的 AKT 及其磷酸化水平。而后，按照“1.2.5”及“1.2.7”部分中的步骤，检测4组细胞的凋亡水平及线粒体ROS水平，并通过“1.2.8”部分中的步骤检测经 PBS或二甲双胍处理的（GR）50-SK细胞的线粒体形态。1.2.12ATP 浓度检测利用 ATP 检测试剂盒对“1.2.11”部分中的4组细胞的ATP浓度进行检测，即于多功能酶标仪上检测细胞的相对光单位（relative light unit，RLU）值，并根据标准曲线（ATP标准品的RLU值）计算不同组别细胞的ATP浓度。具体操作步骤参见试剂盒说明书。1.3统计学分析采用Image J软件进行图像处理、细胞数目统计。采用Microsoft Excel 2019软件进行数据分析及统计图制作。定量资料用xs表示，2组间比较采用双尾t检验。P0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1稳转细胞株的构建及（GR）50蛋白对细胞凋亡水平、线粒体形态、ROS水平的影响采用Western blotting对已构建的GFP CTRL-SK、（GR）50-SK细胞中FLAG标签蛋白的表达水平进行检测，结果（图1A）显示与GFP CTRL-SK细胞相比，（GR）50-SK细胞能够稳定表达（GR）50蛋白C末端的FLAG 标签蛋白；同时，荧光显微镜观察发现 GFP CTRL-SK 细胞能够稳定表达 GFP（图 1B）。继而提示，（GR）50-SK 及 GFP CTRL-SK 稳转株构建成功。随后，利用 PI 染色检测 GFP CTRL-SK、（GR）50-SK细胞的凋亡水平，结果（图1C）显示（GR）50-SK细胞中 PI 阳性细胞数量显著多于 GFP CTRL-SK 细胞（P=0.016），提示（GR）50-SK细胞的凋亡水平较高。为分析由（GR）50引起的细胞凋亡水平升高是否与线粒体损伤相关，我们首先对（GR）50与线粒体在细胞内的位置关系进行分析，结果（图 1D）显示（GR）50与TOM20或HSP90（线粒体基质蛋白）存在部分共定位。而后，我们利用MitoSOX Red就（GR）50对线粒体中ROS水平的影响进行评估，结果（图1E）显示（GR）50-SK细胞中ROS水平较GFP CTRL-SK细胞有明显升高，提示（GR）50蛋白可导致线粒体的功能受损。最后，利用透射电子显微镜观察该2种细胞的线粒体形态及结构，结果（图1F、G）显示与GFP CTRL-SK细胞相比，（GR）50-SK细胞中形态正常的线粒体数量较少（P=0.000），线粒体短径有所增加（P=0.010）；且形态存在明显异常，主要表现为内膜连续性破坏、空泡形成、线粒体嵴断裂模糊、自噬小体形成等。842冯奕源，等二甲双胍改善由C9ORF72 肌萎缩侧索硬化/额颞叶痴呆相关多聚甘氨酸-精氨酸诱导的线粒体损伤http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（7）Average PI+cell number/nGFP CTRL-SK(GR)50-SKP=0.016PIWhite field15 000A45 000Normal mitochondria/%P=0.000MitoSox/Hoechst33342FLAG/TOM20/DAPI/MERGEGFP CTRL-SK(GR)50-SKGFP CTRL-SK(GR)50-SKGFP CTRL-SK(GR)50-SKGFP CTRL-SK(GR)50-SKFLAG/HSP90/DAPI/MERGEP=0.010FEGFP/DAPIGFP CTRL-SKFLAG-actin0510152025GFP CTRL-SK(GR)50-SKGFP CTRL-SK(GR)50-SKGFP CTRL-SK(GR)50-SKGFP CTRL-SK(GR)50-SK02040608010000.20.40.60.8Short diameter of mitochondria/mBCDGNote：A.Detection of FLAG-tag protein expression in cells by Western blotting.B.Observation of GFP signal in GFP CTRL-SK cells by fluorescence microscope.Scale bar=50 m.C.Detection of cell apoptosis level by PI staining.Scale bar=50 m.D.Detection of subcellular location of(GR)50 and TOM20 or HSP90 by IF.Scale bar=1 m.E.Detection of mitochondrial ROS level of(GR)50-SK and GFP CTRL-SK cells by MitoSOX Red superoxide indicator staining.Red fluorescence represents intracellular ROS,and blue fluorescence represents DAPI-stained nucleus.Scale bar=100 m.F.Observation of mitochondrial morphology and structure of cells by transmission electron microscope.Scale bar=2 m.G.Quantification analysis of the proportion of normal mitochondria and length of mitochondrial short diameter.图1稳转细胞株的构建及(GR)50蛋白对细胞凋亡水平、线粒体功能、形态的影响Fig 1Construction of stable transfected cell lines and effect of(GR)50 on cell apoptosis levels,mitochondrial function and morphology8432023,43（7）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.7 Jul.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)2.2（GR）50蛋白促进线粒体 ROS 升高及细胞凋亡的机制分析采 用 Western blotting 检 测（GR）50-SK、GFP CTRL-SK细胞中AKT及其磷酸化水平，结果（图2A）显示与 GFP CTRL-SK 细胞相比，（GR）50-SK 细胞的AKT表达未发生明显改变，但其磷酸化水平显著降低。为进一步明确AKT磷酸化水平降低在由（GR）50导致的线粒体损伤及细胞凋亡中的作用，我们利用AKT磷酸化激动剂SC79处理（GR）50-SK细胞并采用Western blotting进行检测，结果（图2B）显示SC79可显著促进AKT的磷酸化。而后，行MitoSOX Red超氧化物指示剂染色及PI染色检测，结果（图2C、D）显示在SC79作用后，（GR）50-SK细胞线粒体中的红色荧光强度变弱，PI染色阳性细胞数量明显减少；继而提示，AKT磷酸化水平增加可显著降低该细胞线粒体的ROS水平并减少细胞凋亡。2.3二甲双胍对细胞中AKT磷酸化水平、线粒体功能损伤及细胞凋亡的影响为明确二甲双胍能否有效改善由（GR）50导致的AKT磷酸化水平降低，本研究采用二甲双胍分别处理（GR）50-SK、GFP CTRL-SK细胞后，通过Western blotting、MitoSOX Red超氧化物指示剂染色、透射电子显微镜观察、ATP浓度检测、PI染色等评估细胞的AKT及其磷酸化水平、线粒体ROS水平、线粒体形态、线粒体生成ATP的能力及细胞凋亡水平。结果如图3所示。Western blotting的结果（图3A）显示，与15 000A45 000BC60 00060 000DMSOSC79D45 00060 00060 000DMSOSC79PIWhite field-actinAKTphospho-AKT(T308)FLAG-actinAKTphospho-AKT(T308)GFP CTRL-SK(GR)50-SKDMSOSC79(GR)50-SKMitoSox/Hoechst33342(GR)50-SK(GR)50-SKNote：A.Detection of the expression levels of AKT and phosphorylated AKT in cells by Western blotting.B.Detection of the effect of SC79 on AKT and phosphorylated AKT levels in(GR)50-SK cells by Western blotting.C.Detection of the effect of SC79 on mitochondrial ROS level of(GR)50-SK cells by MitoSOX Red superoxide indicator staining.Red fluorescence represents intracellular ROS,and blue fluorescence represents DAPI-stained nucleus.Scale bar=10 m.D.Detection of the effect of SC79 on cell apoptosis level by PI staining.Scale bar=100 m.图2(GR)50对AKT磷酸化水平的影响及调控AKT磷酸化对线粒体ROS水平、细胞凋亡水平的影响Fig 2Effect of(GR)50 on AKT phosphorylation level and the effect of regulating AKT phosphorylation on mitochondrial ROS level and cell apoptosis level844冯奕源，等二甲双胍改善由C9ORF72 肌萎缩侧索硬化/额颞叶痴呆相关多聚甘氨酸-精氨酸诱导的线粒体损伤http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（7）DCEPBSMet00.20.40.60.81.01.21.4PBSMet15 00060 00060 00035 000AB01020304050FMetPBSPBSMetAKTGAPD