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连续OCT监测纳米粒子累积在生物组织
摘要 在这项研究中，纳米粒子渗透和累积在生物组织的动态过程通过非侵略性的OCT成像方法监测。金纳米壳和二氧化钛纳米粒子用来研究。纳米粒子渗透和累积在生物组织中的过程伴随着皮肤光学特性的改变，这将会影响OCT图像。连续OCT监测纳米粒子渗透到皮肤的过程显示这些变化会在纳米粒子作用到表面后的30分钟内出现；纳米粒子累积的最大浓度在纳米粒子作用后的1.5-3小时内可以观察的到。OCT信号的数字处理显示了在真皮上下层间的对比度有所增加，毛囊边界在60-150分钟内对比度降低。投射电子显微技术证实了两种纳米粒子在生物组织中的累积。这项研究的新颖之处是能够在体内表现OCT监测纳米粒子的动态过程和在活体组织的再分布。

介绍
纳米粒子有独特的物理，化学和生物特性，对生物医学有很大的应用。碳纳米管，富勒烯，量子点，和各种金属，金属氧化物纳米粒子目前都在被广泛研究。在金属纳米粒子中的特别之处是所谓的等离子共振的纳米粒子，例如，金纳米壳。它们可以用于药物定向传输，如同生物传感器，也用于光学生物成像。二氧化钛纳米粒子起初被用于化妆品产业中的紫外线屏蔽剂，因此了解它们穿透皮肤的特性非常重要。二氧化钛纳米粒子在可见光范围内有很强的反向散射，在近红外光范围内吸收性很小。这种特性有利于光学可视化。
虽然纳米粒子在生物医学中有大量的研究，但是纳米粒子在生物组织中相互作用的机械特性和纳米粒子穿透表面组织的机械特性以及粒子在生物体中的生物分布有待于进一步研究。现在，这些组织用定性评估方法解决，比如透射电子显微镜，光显微镜，共聚焦显微镜，双光子荧光显微镜，和纳米粒子在生物组织累积的定量评估方法，比如原子吸收光谱法和中子活化分析法。然而几乎所有的方法都是侵害性的或者破坏性的和难以实现的。
在生物学和医学的不同领域内，其光学新技术的快速进步使得纳米粒子在活体生物组织中有着快速无害的研究。例如，扩散光学光谱允许我们确定纳米粒子在组织中的定量分布，OCT成像是一个好的工具，它可以通过光学特性的改变对纳米粒子和生物组织的相互作用的过程进行成像研究。使用等离子共振的纳米粒子提高OCT成像对比度已经在组织幻影和体内证实了。光学可视化的方法的基础是通过介质探测光散射和光吸收，光学和物理化学的特性可以探测到个别结构，如生物组织层或者含有这些溶剂的病理区的可视化。通过OCT成像的改变，我们可以总结纳米粒子在生物组织中的渗透和累积，追踪其动态过程。在体内，非侵害性和实时的OCT成像是很值得观察研究的。
在早期的研究中，我们展示了使用金纳米粒子和二氧化钛纳米粒子作为对比剂，用来对皮肤的OCT成像研究的可能性。结果发现，纳米粒子渗透到不同的皮肤结构，从而增加了OCT图像的信息性。
现在实验研究的目标是结合金纳米粒子和二氧化钛纳米粒子的渗透监测皮肤光学特性的改变。
材料和方法
OCT系统
OCT系统生产在应用物理RAS研究所，配置了一个灵活探头用于目前的研究。这个系统有下列特点：探头的外径是2.7mm，探测光波900nm，探测辐射功率2mW，空间分辨率15um，得到一个200×200像素的2D图像的平均时间是1.5s。

纳米粒子
在我们的研究中，我们使用硅芯直径130nm和壳厚15nm的金纳米壳的悬浮液（图1a）。这些粒子在Khlebtsov和Dykman的论文中研究过。纳米粒子的粒度分布是最小的。这些粒子通过PEG分子共价连接到表面来稳定。我们使用低分子量的PEG（5000）。这些纳米粒子通过Khlebtsov等人所详细描述的方法合成而得。纳米粒子悬浮液的浓度是22ug/ml。在波长900nm处金纳米壳有最大消光，这对于OCT技术是最理想的。
我们研究高纯度的二氧化钛纳米粒子（99.999%）。根据制造商提供的信息，这些二氧化钛纳米粒子通过钛醇盐的水解得到。X射线的结构分析显示这些纳米粒子是金红石型和四方点阵的结构。其他阶段和自由的纳米粒子在X射线中看不到。这些粒子具有平均直径54nm的球形结构。基于透射电子显微镜，粒子的粒度分布由图2显示。
这种尺寸的二氧化钛纳米粒子在可见光谱区有一个很大的反向散射系数。据推测，二氧化钛纳米粒子可以用于OCT图像对比。我们通过蒸馏水溶解纳米二氧化钛粉来制备纳米粒子悬浮液。所得的悬浮液浓度1mg/ml（纳米粒子的浓度通过OCT成像实验研究，以使二氧化钛纳米粒子的OCT信号强度可以与金纳米粒子的OCT信号强度相比）。二氧化钛纳米粒子高度聚结；因此，悬浮液在使用之前通过30-40分钟的超声波处理解散。完全打破聚结体所需的最佳时间通过透视电子显微镜发现。

纳米粒子在在体的兔皮肤中的渗透和累积的研究
对兔子（3.5-4kg重）所做的研究保持在标准饲养的条件
在脱毛的兔大腿的健康皮肤上滴加25ul的纳米粒子溶液。光发生变化，这是金纳米壳和二氧化钛纳米粒子引起的，通过OCT连续监测。一个特殊的OCT探头架由胶带固定。探头放在支撑物上向皮肤表面提供连续的均衡压力。在纳米粒子作用15分钟后OCT开始监测。检测时间是3-4小时。每隔30秒得到一个OCT图像。得到的OCT图像总共约有400个。溶液作用前的OCT图像作为对照。对OCT图像的皮肤层进行鉴定与组织学数据比较。纳米粒子在皮肤中通过透射电子显微镜鉴定。我们确定图像中的表皮和上真皮层是单层，含有毛囊和真皮下层。由于真皮层结构的形态特征，或多或少在各层间形成的不同的边界。OCT图像中的毛囊看起来像信号水平低和边缘很强的对角线夹杂物。

结果
健康皮肤的OCT图像没有显示明显的深部真皮层；不同的皮肤结构几乎不能区别。（图3）
在体的皮肤研究可以观察到纳米粒子在皮肤中渗透和累积的动态过程。
在金纳米粒子的情况下，OCT图像的第一个变化发生在纳米粒子作用30分钟后。OCT信号水平在上真皮层略微增加，导致了真皮上下层的可视化（图3c），而与对照组的OCT图像相比这些层是不可分辨的（图3a）。 真皮上层的信号逐渐增加伴随着真皮层对比度的提高。因此，对比度的动态过程与上真皮层的动态变化完全相符。
图4说明了这种现象，给出了由金纳米壳引起的真皮上下的边界对比图。对比图显示了真皮上下层信号强度的不同。信号强度值是由手工选取真皮层区域的每第五个OCT图像信号的平均值所得。
真皮上层信号强度增加的同时，在真皮上层中信号水平低的对角型夹杂物也可以观察的到。通过组织标本的OCT图像比较得出这些夹杂物是毛囊。毛囊在对照组的OCT图像中看不到。监测开始时（开始30分钟后）毛囊的特征是信号强度低。在30-45分钟内观察，夹杂物和真皮（图3c）的边界对比度增加，这是由于上真皮层信号强度增加和毛囊的扩散率低。因此，夹杂物在这个时间是最好对比的。毛囊的信号强度增加导致毛囊和其周围组织的边界的对比度下降。夹杂物的信号强度在55-135分钟期间内逐渐增加是由于粒子的渗透（图3d,e).毛囊在整个观察过程中可以看到。
在纳米粒子作用60分钟后，成像深度开始增加。这伴随着在真皮层中部和深层处有着低信号水平且尺寸和形状不同的夹杂物的可视化（图3e）。图像深度在1-2小时内观察最大，平均是在2.5-3小时内最大（图3f）。
对于二氧化钛纳米粒子有类似的研究。其OCT图像变化的动态过程与在金纳米粒壳的情况下是可比较的，但是上面所描述的变化对于二氧化钛粒子没有那么明显。尤其真皮层间的边界对比度与金纳米壳的情况下的边界对比度相比更不明显。这在图5中的A扫描中可以清楚地看到（反向散射信号在一个固定点的深度分布，通过OCT成像所得）。A扫描是通过所选区域在纳米粒子作用后的不同时刻所得的OCT图像的平均化而得。对于金纳米粒子，其区域的平均OCT图像如图3c,f所示，对于二氧化钛纳米粒子，如图6b,d所示，对于对照组，如图3a,图6a所示。正如上文所说，边界对比度依赖真皮上层的信号水平。明显，含有金纳米壳的信号水平高于二氧化钛纳米粒子的。箭头所指的OCT信号下降的点，对应于真皮层间的边界对比度。OCT信号下降在二氧化钛粒子的情况下比较小（图5），所以边界对比度也比较小。
连续OCT监测揭示了二氧化钛纳米粒子在皮肤附属物（根据皮肤组织学是毛囊）中的累积，这种附属物作为信号水平低的夹杂物在OCT图像中可以看到（图6b).二氧化钛渗透到这些结构中导致夹杂物周围的信号强度增加（图6c)。由于二氧化钛粒子的逐渐累积，夹杂物的OCT信号强度变得像是其周围组织的OCT信号（图6d)，夹杂物变得不再明显。
使用电子显微技术，我们都可以探测皮肤结构中金纳米壳和二氧化钛纳米粒子（图7）。这两种类型的纳米粒子在所有皮肤层和结构中都可以探测的到：在表皮，在结缔组织，在细胞里，在细胞间质。金纳米壳在真皮更深处可以探测到，而二氧化钛粒子主要在上皮细胞和真皮中部观察的到。

讨论
在现在的研究中，我们进行了两种类型的纳米粒子作用在皮肤表面渗透到不同健康皮肤结构的在体OCT图像监测。当OCT探头连续地依附在皮肤上，该方法就可以给出纳米粒子渗透过程的高精准信息。在固定位置所得到的图像对于他们的正确解释非常重要。结果显示，尽管金纳米粒子的光学特性有很多明显的改变，比如真皮上下层的边界对比度和OCT信号水平增加，但是金纳米粒子渗透的动态过程和二氧化钛纳米粒子渗透的动态过程没有显著差别。渗透到生物组织会改变反向散射的强度，这在OCT图像中可以探测到。
有很多因素影响纳米粒子渗透到健康皮肤。纳米粒子，形状，表面电荷，组合物，流体力学直径，溶剂的物理化学性质都会影响皮肤的 渗透。在我们的研究中，我们使用不带电的球形金纳米壳和二氧化钛纳米粒子。大量文献资料显示刚性粒子不像塑料的一样，它不能渗透整个角质层，但是可以穿透毛囊，纳米粒子穿透皮肤非常依赖其尺寸。纳米粒子组合物和表面电荷似乎不太重要。基于这些研究（Alvarez-Roma´n et al. 2004; Borm et al. 2006; Langer2004; Moranti et al. 2001; Ryman-Rasmussen et al.2006; Teichmann et al. 2005; Toll et al. 2004)我们可以总结出纳米粒子被动的穿透表皮，滤泡的路线或者含水的毛孔，是由于其粒子尺寸小于36nm，而更大的粒子穿透滤泡的路线是由于皮肤的结构特性。与上面的研究相比，0.5-1um的铍粒子弯曲地穿透人皮肤的角质层在Tinkle等人的文献中提到。与Tinkle等人相似，我们观察很大的刚性粒子渗透皮肤深处。虽然不清楚纳米粒子穿透完整皮肤的机械性能，但是我们所研究的两种纳米粒子确实可以穿过角质层，这由透射电子显微镜证实。在细胞间质和上皮细胞中探测到纳米粒子，说明它们可以穿透细胞膜和真皮胶原纤维。这个结果可以解释为角质层的厚度在不同身体部位有所变化。人腹部和猪皮经常用来研究。值得注意的是，我们估计这些角质层的厚度是10-20um，至少是兔皮的两倍大。
现在在纳米粒子研究上所采用的方法缺少探测纳米粒子穿透活体组织的动态过程的能力。但是Kim等人在仓鼠发育不良的脸颊区域的研究展示了OCT成像具有这样的可能性。
纳米粒子引起的OCT图像的改变可以研究纳米粒子穿透皮肤的动态过程。我们假设纳米粒子作用在皮肤表面30分钟后，它们就开始由表皮向真皮上层扩散。这伴随着下面所述的OCT图像的改变：真皮的信号强度和边界对比度增加（图3c)，毛囊的信号水平低这是因为在真皮中的扩散速率比穿过卵泡壁快。基于夹杂物边界的对比图（图4），我们可以猜测纳米粒子穿透真皮上层20多分钟后就开始向毛囊扩散。真皮层间的边界对比度可能是由于扩散速率的差异。从结构上说，真皮下层的结构浓度更大，纳米粒子穿过这些下层边界时速率就会减慢。OCT探测纳米粒子穿透皮肤附属物伴随着附属物信号强度的增加，同时边界对比度下降。
得到的结果分析表明真皮层间的边界对比度提高和毛囊边界对比度下降是纳米粒子穿透的重要指标。根据我们的数据，这种情况发生在纳米粒子作用后的60-150分钟内。这是观察纳米粒子穿透皮肤结构最好的时间段。
纳米粒子在皮肤中累积的连续成功研究对于我们研究纳米粒子累积在局部皮肤下的肿瘤组织是很有希望的。了解有关纳米粒子存在的皮肤的光学变化，我们可以实时地评估纳米粒子在肿瘤中累积的程度。这样我们可以高精度的确定纳米粒子在肿瘤中累积的时间。OCT监测对于使用等离子共振的纳米粒子控制局部激光热疗变得不可或缺。

总结
现在的研究主要关注通过连续OCT监测，在体研究不同类型的纳米粒子在健康组织中的累积。OCT技术揭示了纳米粒子穿透皮肤，在不同皮肤层和结构的累积，因而改变生物组织的光学特性。连续OCT监测这些改变可以最准确地追踪发生的动态过程，包括纳米粒子穿透皮肤附属物。纳米粒子累积在皮肤中通过电子显微镜证实。因此，我们的研究结果显示OCT对于控制纳米粒子在生物组织中的累积是一个目标技术，也许是一个很有用的工具，用来评估纳米粒子在肿瘤中累积的最大时间，以便用来更有效的治疗。