动物双歧杆菌联合传统发酵剂对发酵牛乳、牦牛乳品质的影响.pdf

潘坤，陈寒霜露，周海栋，等.动物双歧杆菌联合传统发酵剂对发酵牛乳、牦牛乳品质的影响 J.食品工业科技，2023，44（18）：181192.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022110167PAN Kun,CHEN Hanshuanglu,ZHOU Haidong,et al.Effects of Bifidobacterium animalis subsp.lactis Combined with TraditionalStarter Culture on the Quality Characteristics of Fermented Cow Milk and Yak MilkJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(18):181192.(in Chinese with English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022110167 生物工程 动物双歧杆菌联合传统发酵剂对发酵动物双歧杆菌联合传统发酵剂对发酵牛乳、牦牛乳品质的影响牛乳、牦牛乳品质的影响潘坤1，陈寒霜露1，周海栋1，廖彬旭1，李巧艳1，唐善虎1，李思宁1,*，刘亮2,*（1.西南民族大学食品科学与技术学院，四川成都 610041；2.川北医学院，四川南充 637100）摘要：为探究不同发酵剂及不同发酵底物对发酵乳品质的影响，本文将动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalissubsp.lactis，Ba）与传统酸奶发酵剂（SL）共培养，测定了发酵牛乳、牦牛乳及牛乳与牦牛乳混合乳（1:1）的酸化能力、活菌数、持水力、蛋白水解活力、流变特性、物理稳定性、微观结构、挥发性风味物质及感官特性。结果表明，对于相同的发酵底物，Ba 联合 SL 发酵，可显著提高发酵乳的酸化能力和活菌数（P0.05）；SL 和 Ba 共发酵能显著增加发酵牛乳和发酵混合乳的持水力（P0.05），使发酵混合乳在整个冷藏期间持水力高于其余各组，其中第 7 d 最高，为 45.68%；此外，联合发酵提高了发酵牦牛乳的粘弹性，但降低了发酵牛乳和发酵混合乳的粘弹性。对于相同的发酵剂，发酵牛乳的酸化能力、活菌数、物理稳定性、感官评分显著高于其余两种发酵乳（P0.05）；发酵牦牛乳的粘弹性最强；发酵混合乳持水力在整个冷藏期间都显著高于其余两种发酵乳（P0.05），凝胶网络结构最致密，关键风味物质种类较多，蛋白水解活力介于其余两种发酵乳之间。本研究表明，Ba 联合 SL 共培养可以提高发酵乳的品质；相比于牦牛乳，牛乳和混合乳更适合作为发酵底物。关键词：发酵乳，动物双歧杆菌，共发酵，牦牛乳，品质特性本文网刊:中图分类号：TS252.54 文献标识码：A 文章编号：10020306（2023）18018112DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022110167EffectsofBifidobacteriumanimalissubsp.lactisCombinedwithTraditionalStarterCultureontheQualityCharacteristicsofFermentedCowMilkandYakMilkPANKun1，CHENHanshuanglu1，ZHOUHaidong1，LIAOBinxu1，LIQiaoyan1，TANGShanhu1，LISining1,*，LIULiang2,*（1.College of Food Science and Technology,Southwest Minzu University,Chengdu 610041,China；2.North Sichuan Medical Collage,Nanchong 637100,China）Abstract：To evaluate the effects of different starter cultures and different fermentation substrates on the quality offermented milk,the samples were prepared with Bifidobacterium animalis subsp.lactis(Ba)in co-cultures with traditionalyogurt starter cultures(SL),and the acidification profile,viable bacteria count,water-holding capacity,proteolytic activity,rheological property,physical stability,microstructure,volatiles and sensory characteristic of fermented cow milk,fermented yak milk and fermented milk mixtures of cow to yak milk ratios of 1:1 were investigated.The results showed that 收稿日期：20221116 基金项目：西南民族大学中央高校基本科研业务费专项资金项目（ZYN2022111）；四川省科技成果转化项目（2022ZHCG0017）。作者简介：潘坤（1999），男，硕士研究生，研究方向为食品加工与安全，E-mail：。*通信作者：李思宁（1988）（ORCID：0000000152604015），女，博士，副教授，研究方向：食品加工与贮藏技术，E-mail：。刘亮（1982）（ORCID：0000000344428618），男，硕士，讲师，研究方向：食品卫生与安全，E-mail：。第 44 卷 第 18 期食品工业科技Vol.44 No.182023 年 9 月Science and Technology of Food IndustrySep.2023 for the same fermentation substrates,Ba-SL significantly improved the acidification property and viable bacteria count offermented milk(P0.05).Ba-SL significantly enhanced the water-holding capacity of fermentedcow milk and fermented mixed milk(P0.05),and there was a higher water-holding capacity in fermented mixed milk incomparison to fermented cow milk and fermented yak milk during the whole refrigeration period,with the largest values ofwater-holding capacity being 45.68%on the 7 d.SL starter in conjunction with Ba increased the viscoelasticity offermented yak milk,but decreased the viscoelasticity of fermented cow milk and fermented mixed milk compared to thesingle-culture of SL.For the same starter cultures,the acidification property,viable bacteria count,physical stability,andsensory score of fermented cow milk were significantly higher than those of the other groups (P0.05),and theviscoelasticity of fermented yak milk was the highest among the fermented milk.The water-holding capacity of fermentedmixed milk was significantly higher than those of the other groups throughout the refrigeration period(P0.05),and the gelnetwork structure and key volatiles of fermented mixed milk was the densest and more diverse among the three fermentedmilk,while the proteolytic activity of fermented mixed milk was between fermented cow milk and fermented yak milk.Thisstudy suggested that Ba in co-culture with SL could improve the quality of fermented milk,and both of cow milk andmixtures of cow and yak milk were more suitable to prepare fermented milk compared to yak milk.Keywords：fermented milk；Bifidobacterium animalis subsp.lactis；co-fermentation；yak milk；quality characteristics 发酵乳是由乳酸菌在代谢过程中产酸，使原料乳经过酸化作用形成的风味独特、营养价值高、易消化的乳制品。益生菌常与传统发酵剂复合用于生产益生菌发酵乳1。2001 年，WHO 和 FAO 将益生菌定义为“经适量食用后有益于宿主健康的活微生物”2，益生菌在预防和治疗人类亚健康或疾病方面的应用已经得到了广泛的报道3。现如今人们普遍追求更加健康的生活方式，益生菌的地位愈加凸显，而发酵乳制品则是其主要载体。工业生产发酵乳大多使用牛乳作为主要发酵底物，随着市场对含益生菌的非牛乳制品需求不断增加4，牦牛乳由于含有比牛乳更高的蛋白质、钙、磷、铁、锌等矿物质含量5，且具有潜在的抗癌、降血压、抗氧化和降低胆固醇的特性，也被广泛用于生产益生菌发酵乳。近年来，国内外学者对不同发酵组合制备的发酵乳也展开了一些研究。闫瑞宇等6采用 GC-IMS技术对植物乳杆菌、动物双歧杆菌联合商业发酵剂制备的荞麦发酵乳与普通发酵乳以及商业发酵剂制备的市售发酵乳进行分析，结果表明，荞麦发酵乳中特征性风味物质为 3-甲基丁醛、2-甲基丁醛等，市售发酵乳中为 2-戊酮、丁醛等，而实验室自制发酵乳中风味物质种类较少；此外，荞麦发酵乳乙酸含量显著高于市售发酵乳。Zhang 等7以发酵剂 MY105 与发酵乳杆菌 HY01 分别制备 MY105 发酵牦牛乳、HY01 发酵牦牛乳、共发酵牦牛乳、共发酵牛乳，并以传统发酵牦牛乳作为对照，结果表明，共发酵牦牛乳比传统发酵牦牛乳、HY01 发酵牦牛乳、共发酵牛乳具有更高的表观粘度，同时其共轭亚油酸含量显著高于单种发酵剂发酵乳。任海东8以八种商业发酵剂分别发酵豆乳与牛乳，结果发现不同发酵剂在不同底物中表现出不同的发酵特性。目前，暂未见关于动物双歧杆菌联合传统发酵剂共培养对发酵牛乳、牦牛乳及其混合乳品质影响的报道。本试验研究了动物双歧杆菌与传统发酵剂共培养条件下，发酵乳在 4 冷藏 28 d 过程中酸化能力、活菌数、持水力、蛋白水解活力、流变特性、物理稳定性、微观结构、挥发性风味物质及感官特性变化，以探讨不同发酵组合对发酵乳品质的影响，为益生菌发酵乳工业化生产提供参考。1材料与方法 1.1材料与仪器全脂牛乳粉（蛋白质 23.8 g/100 g、脂肪 28.4 g/100 g、碳水化合物 40.6 g/100 g）新西兰 Maxigenes 公司；全脂牦牛乳粉（蛋白质 28.0 g/100 g、脂肪 26.0 g/100 g、碳水化合物 36.5 g/100 g）红原牦牛乳业有限责任公司；嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌混合（1:1）直投式商业发酵剂（SL）Danisco（北京）菌种有限公司；动物双歧杆菌 21716（Ba）中国工业微生物菌种保藏中心；MRS 肉汤培养基、MRS 培养基、MC 培养基杭州微生物试剂有限公司；BL 培养基青岛海博生物技术有限公司；酚酞、乙醇、十二烷基硫酸钠、邻苯二甲醛、甲醇、三氯乙酸、L-亮氨酸、异丙醇、石油醚、硫酸、氢氧化钾、氯化钠、戊二醛、乙醇、叔丁醇，成都科隆化学品有限公司；四硼酸钠天津瑞金特化学品有限公司；氢氧化钠成都金山化学试剂有限公司；-硫基乙醇百灵威科技有限公司；上述试剂均为分析纯。MP511 型 pH 计上海三信仪表厂；V1000 紫外可见分光光度计上海翱艺公司；5804R 冷冻离心机德国 Eppendorf 公司；SW-CJ-1F 超净工作台苏州市安泰空气技术有限公司；MLS-3020 高压灭菌锅日本三洋电器有限公司；TA-XT plus 质构仪英国 Stable Micro Systems 公司；DISCOVERYHR-1 旋转流变仪美国 TA 仪器；LUMiSizer 611 稳 182 食品工业科技2023 年 9 月定分析仪德国 Lum 公司；DHP-9162D 恒温培养箱上海齐欣科学仪器有限公司；D-37520 真空冷冻干燥机德国 Christ 公司；Apreo 2C 扫描电子显微镜美国 Thermo 公司；Trace DSQ 气相色谱质谱联用仪（配 Tripplus 自动进样器）美国 Thermo 公司；50/30 m DVB/CAR/PDMS 萃取头美国 Supelco公司。1.2实验方法 1.2.1 菌种活化动物双歧杆菌在 MRS 肉汤中于37 厌氧条件下复活 24 h，再在 MRS 肉汤培养基中连续活化两代后，转移至灭菌牛乳中，在 37 培养 89 h，使活菌数达到 108 CFU/g。1.2.2 试验设计分别将牛乳粉和牦牛乳粉加入60 温水中（乳粉:水=1:7），搅拌至完全溶解，4 过夜使乳粉充分水合，获得固形物含量为 12.5%（w/w）的复原牛乳和复原牦牛乳。使用 90 灭菌 10 min并冷却至 4345 的牛乳（M）、牦牛乳（Y）、牛乳与牦牛乳 1:1 复配乳（M+Y）作为发酵底物。在所有处理中，SL 按原料乳质量的 0.1%（w/w）添加，而 Ba 不添加或按原料乳质量的 107 CFU/g 添加，搅拌均匀后于 42 发酵至 pH4.6，获得 SL/M、SL-Ba/M、SL/Y、SL-Ba/Y、SL/M+Y、SL-Ba/M+Y 发酵乳。随后，将各组发酵乳转移至（41）冰箱冷藏 1、7、14、21、28 d，取样测定指标。1.2.3 酸化能力测定使用 pH 计测定发酵乳的 pH。滴定酸度测定参照 Li 等9的方法。发酵乳样品 5.0 g与 5 mL 去离子水混匀，加入 2 滴 0.5%酚酞（95%乙醇溶液作为溶剂），用 0.1 mol/L NaOH 标准溶液滴定至持续的淡粉色。根据消耗 NaOH 标准溶液的量计算滴定酸度（T）。1.2.4 活菌数测定活菌数参照 GB 4789.35-201610方法。发酵乳样品 25 g 与生理盐水 225 mL 充分混合。吸取 1 mL 菌液用生理盐水稀释适宜的倍数后，分别使用 MRS 培养基、MC 培养基和 BL 培养基对保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和动物双歧杆菌进行平板计数。乳酸菌活菌数以 CFU/g 发酵乳表示。1.2.5 持水力测定持水力参照吴淼等1的方法测定。取一定质量（W0）发酵乳样品于离心管，8000g离心 15 min（4），倾去上清液，称量剩余样品的质量（W）。按照公式（1）计算持水力（Water holdingcapacity，WHC）。WHC(%)=WW0100式（1）1.2.6 蛋白水解活力测定蛋白水解活力参照Church 等11的方法。邻苯二甲醛（OPA）试剂配制：0.1 mol/L 四硼酸钠溶液 50 mL、20%十二烷基硫酸钠溶液 5 mL、OPA（80 mg 邻苯二甲醛溶解于 2 mL甲醇，加入-疏基乙醇 200 L 与之混匀）2.2 mL 混合后，用去离子水定容至 100 mL。发酵乳样品 2.0 g和去离子水1 mL 混匀，加入0.75 mol/L 三氯乙酸5 mL，混合均匀并静置 10 min，4、4000g 离心 10 min，收集上清液。取上清液或去离子水（对照）200 L，加入 OPA 试剂 4 mL，混匀，室温下反应 10 min 后于340 nm 波长处测定吸光度。1.2.7 流变特性流变特性参照任然12的方法，并略有修改。用 HR-1 流变仪测定发酵乳的流变特性。实验条件为：频率扫描在 25 环境下，角频率由 0.1100 rad/s，每个数量级点数为 16 个；剪切扫描在 25 环境下，剪切速率由 1 增加到 100 s1，每个数量级点数为 25 个。1.2.8 物理稳定性用稳定性分析仪测定发酵乳的稳定性。吸取 0.5 mL 发酵乳置于 2 mm PC 管中，光源波长 865 nm，谱线条数为 255 条，时间间隔为每10 s 扫描一次，转速为 2500 r/min，温度为 25 进行检测。1.2.9 微观结构微观结构参考 Kristo 等13的方法。用勺子挑取冷藏 28 d 发酵乳中心凝块，大小约为：2 cm2 cm2 cm，在 4 条件下于 2.5%的戊二醛溶液中固定 12 h 以上，然后用生理盐水冲洗两次，每次 15 min。分别用 50%、70%和 90%乙醇进行梯度洗脱，每次洗脱 10 min，用 100%乙醇洗脱三次，每次 10 min，再用叔丁醇置换 10 min。将样品放入80 预冷 24 h 以上，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥 12 h 以上。采用离子溅射仪在样品表面镀铂金膜，利用发射扫描电子显微镜观察样品的微观结构。1.2.10 挥发性风味物质使用 GC-MS 联用仪测定发酵乳的挥发性风味物质，参照任然12的方法。发酵乳样品 5 g 装入顶空进样瓶内，加入 2 g 氯化钠，加盖密封，样品预孵化 10 min 后用萃取头吸附 30 min，220 解析附 3 min，进行 GC-MS 分析。色谱条件：采用 TR-FFAP 色谱柱（30 m0.25 mm0.25 m）；载气为 99.999%氦气，流速为 1.0 mL/min，采用不分流模式；进样口温度为 230；升温程序：起始温度 40 保持 3 min，以 5/min 升到 140，并持续 3 min，再以 7/min 升到 220，并保持 3 min，解析时间2 min。质谱条件：EI，正离子扫描模式，70 eV；离子源温度为 250，质量扫描范围为 33450 amu。发酵乳中风味物质的鉴定以其保留时间和 NIST 08 标准库比对确定，最终报道正反匹配因子均大于 800的结果。挥发性风味物质含量（%）采用面积归一化法，用各物质的峰面积占总峰面积的百分比表示，即相对峰面积。参照刘登勇14的方法，采用相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）法评价不同发酵乳样品的香气组分对主体香味的贡献程度。定义对样品整体风味贡献程度最大的组分 ROAVstan为 100，对其他风味化合物的 ROAV 按公式（2）计算：ROAVi=100CiCstanTstanTi式（2）式中：Ci和 Ti为该挥发性化合物的相对含量第 44 卷 第 18 期潘坤，等：动物双歧杆菌联合传统发酵剂对发酵牛乳、牦牛乳品质的影响 183 （%）和感觉阈值（g/kg）；Cstan和 Tstan为对整体风味贡献最大的挥发性化合物的相对含量（%）和感觉阈值（g/kg）。1.2.11 感官特性邀请 6 名经过感官评价训练的人员，男女各一半，从产品的色泽、组织状态、滋味以及气味四方面进行感官评定。满分为 100 分，感官评分标准参照李思宁等15的方法，见表 1。表 1 发酵乳的感官评分标准Table 1 Sensory evaluation criteria of fermented milks项目评分标准分值（分）色泽（15分）乳白色，分布均匀，无杂色1115颜色分布不均，整体偏黄色610颜色不协调，有明显色差05组织状态（30分）无乳清析出，粘稠度适宜2130少量乳清析出，有小颗粒，粘稠度较适宜1120乳清析出较多，有颗粒，偏稠/稀010滋味（40分）酸甜适宜，口感细腻3140偏酸/甜，口感细腻2130偏酸/甜，口感略粗糙1120过酸/甜，口感粗糙010气味（15分）奶香味浓1115有奶香味610奶香味淡05 1.3数据处理所有试验均重复三次，结果以平均值标准偏差表示。使用 SPSS 26.0 单因素方差分析（ANOVA）中的 Duncan 法检测各处理平均值的差异显著性；使用一般线性模型中的单变量检测不同组别发酵乳在冷藏期间的差异显著性。P0.05 表示差异显著。运用 Origin 2021 软件作图。2结果与分析 2.1不同发酵剂与发酵底物对发酵乳酸化能力的影响测定酸化能力能够了解不同发酵剂在发酵体系中产酸速度的快慢。冷藏期间，发酵乳的 pH 和滴定酸度变化结果见图 1 和图 2。从图 1 可以看出，随着冷藏时间延长，各组发酵乳 pH 显著降低（P发酵混合乳组发酵牛乳组。牛乳和牦牛乳中的乳糖含量不同，导致酸的积累速度和总量不同16。对于相同的发酵底物，动物双歧杆菌参与发酵可显著降低发酵乳的 pH（P0.05），这可能归因于动物双歧杆菌与传统发酵剂共同作用于乳基质，促进了乳糖的分解和乳酸的积累。这与李思宁等17报道的结果一致。滴定酸度可以反映包括肽和游离氨基酸残基在内的所有酸性基团总和18。由图 2 可以看出，随着冷藏时间延长，各组发酵乳的滴定酸度显著增加（P0.05），其上升趋势与 pH 显著降低的趋势相呼应。采用同一发酵剂条件下，不同发酵乳酸度由高到低依次为：发酵牛乳、发酵混合乳、发酵牦牛乳。SL-Ba/M 组的酸度显著高于 SL/M 组，SL-Ba/Y 组的酸度显著高于 SL/Y 组，SL-Ba/M+Y 组的酸度显著高于 SL/M+Y 组（P0.05），不难看出，动物双歧杆菌参与发酵可显著增加发酵乳的酸度。17142128708090100110滴定酸度(T)冷藏时间(d)SL/MSL-Ba/MSL/YSL-Ba/YSL/M+YSL-Ba/M+YeBCDeAdDeABCdCDdABdCDdAdBCcDcCDcABcCDcAbDcBCbCDbABbBCbAabCbBaBaAaBCaAaCaBaBCaA图 2 发酵乳在冷藏期间的滴定酸度Fig.2 Titratable acidity of fermented milk during refrigeration 2.2活菌数冷藏期间发酵乳中活菌数变化见图 3。由图 3可以看出，随着冷藏时间增加，所有发酵乳中保加利亚乳杆菌活菌数在 17 d 显著增加，随后显著下降（P0.05）。推测在冷藏前期，保加利亚乳杆菌处于对数期，且发酵乳中营养物质充足，保证了乳酸菌的生长繁殖；到冷藏中后期，乳酸菌度过对数生长期，且发酵乳中营养物质逐渐消耗，活菌数减少。武士美19也在发酵乳中发现保加利亚乳杆菌有类似的变化趋势。对于相同的乳基质，含有动物双歧杆菌的发酵乳中保加利亚乳杆菌数显著高于不含动物双歧杆菌的发酵乳（P0.05），可能是共培养体系中，三株菌能够互相促进生长20，因此添加动物双歧杆菌能够提高并维持嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌的数量。SL/M 组发酵乳中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌活菌数显著高于 SL/Y 组和 SL/M+Y 组，SL-Ba/M 组显著高于SL-Ba/Y 和 SL-Ba/M+Y 组（P0.05），原因是这两种乳酸菌主要利用乳糖作为碳源为其生长提供能量21，而牛乳中乳糖含量显著高于牦牛乳16。171421284.14.24.34.44.54.6pH冷藏时间(d)SL/MSL-Ba/MSL/YSL-Ba/YSL/M+YSL-Ba/M+YaDaBCDaABaCDbBCbDbAbBCbABaAaBCbCDcABcCcAcBCcABcCdBdDdAdBCdABdCDdBeDdAeBCeBeCD图 1 发酵乳在冷藏期间的 pHFig.1 pH of fermented milk during refrigeration注：不同小写字母表示不同冷藏时间差异显著（P0.05），不同大写字母表示不同处理样品差异显著（P0.05）；图 2图 5 同。184 食品工业科技2023 年 9 月嗜热链球菌活菌数在 17 d 内显著增加，随后显著减少（P0.05）。这与任然12研究结果一致。嗜热链球菌活菌数的下降与发酵乳酸度的升高有关，随着乳酸菌分解乳糖产酸，体系中酸度升高，嗜热链球菌的生长受到抑制，同时，随着储藏时间的延长，体系中嗜热链球菌能利用的营养成分也逐渐减少，导致嗜热链球菌活菌数减少22。各组发酵乳中动物双歧杆菌活菌数在 17 d 增显著加，随后显著减少（P0.05）。在整个冷藏期间，SL-Ba/M 组的动物双歧杆菌活菌数显著高于 SL-Ba/Y 和 SL-Ba/M+Y 组（P0.05），推测是乳糖水解后会生成低聚糖23，而牛乳中乳糖的含量显著高于牦牛乳16，使得不同乳基质中低聚糖的组成和含量有所区别。又有研究表明，低聚糖可以刺激双歧杆菌的生长24，进而导致不同的发酵乳中动物双歧杆菌的数量有所不同。2.3持水力酪蛋白形成的三维网状结构决定了发酵乳的持水力，较高的持水力会使发酵乳较长时间保持产品的感官及质地。由图 4 可以看出，在冷藏期间，所有发酵乳持水力均在 17 d 显著增加，随后显著减少（P0.05）。冷藏初期（17 d），酪蛋白胶束之间的吸引力强度较弱，从而保持了凝胶中的较多孔隙，减少自然脱水，导致持水力增加25。冷藏 7 d 之后，pH 持续降低导致凝胶中蛋白网络重排，粒子-粒子连接数量增加，使得凝胶收缩，排出其间隙液即乳清，从而降低持水力26。相同的变化趋势也被潘潇27报道。121 d，SL/Y 组持水力显著高于 SL/M 组和 SL/M+Y组（P0.05），但SL/Y 和 SL/M 组持水力显著高于SL/M+Y 组（P0.05）。在 114 d，SL-Ba/M+Y 组的持水力显著高于 SL-Ba/M组和 SL-Ba/Y 组（P0.05）；在 2128 d，SL-Ba/M+Y 组的持水力显著高于 SL-Ba/M 组（P0.05），推测发酵混合乳在 SL-Ba 的作用下可能会形成更加细密的网状结构来更好地维持发酵乳的持水力。171421283545304050WHC(%)冷藏时间(d)SL/MSL-Ba/MSL/YSL-Ba/YSL/M+YSL-Ba/M+YbDbBbBbBbCbAaCaBaBaBaCaAcDcCcBcBcDcAcBCdBdAdAdCdAdCdBeCeABeDdA图 4 发酵乳在冷藏期间的持水力Fig.4 Water-holding capacity of fermented milkduring refrigeration 2.4蛋白水解活力牛乳中的游离氨基酸和肽仅能支撑乳酸菌繁殖23 代，因此乳酸菌需要借助自身蛋白水解系统将乳中酪蛋白降解成氨基酸和肽来满足生长。在这个过程中，因蛋白质水解产生的游离氨基酸和小肽也会改善发酵乳的风味28。从图 5 可以看出，SL/M 组、SL-Ba/M 组的蛋白水解活力在冷藏期内持续上升（P0.05）；SL/Y 组、SL-Ba/Y 组、SL/M+Y 组的蛋白水解活力在 114 d 显著上升，随后显著下降（P0.05）。这表明，发酵乳的蛋白水解活力与发酵剂、发酵底物关系较大。在发酵牛乳组中，SL-Ba/M 组的蛋白水解活力在整个冷藏期显著高于 SL/M 组（P0.05），原因是添加动物双歧杆菌的组总活菌数要多于未添加动物双歧杆菌的组，并且动物双歧杆菌也拥有一定的游离氨基释放能力17。在发酵牦牛乳组中，SL-Ba/Y 组的蛋白水解活力在 1、21 d 显著高于 SL/Y 组（P0.05），推断动物双歧杆菌能够很好的维持发酵牦牛乳中的蛋白水解活力，使 SL-Ba/Y 组蛋白水解活力的上升速度快于 SL/Y 组，下降速度慢 17142128020406080100120140冷藏时间(d)冷藏时间(d)冷藏时间(d)SL/MSL-Ba/MSL/YSL-Ba/YSL/M+YSL-Ba/M+YSL/MSL-Ba/MSL/YSL-Ba/YSL/M+YSL-Ba/M+Ye保加利亚乳杆菌数(107 CFU/g)嗜热链球菌数(107 CFU/g)双歧杆菌数(107 CFU/g)CeABbBCbAcCcAaBaAaEaCDaDaCbB bAbDbDbDbCcBcAcEcDcCcCdA dAcDdCcBdB17142128020406080100120140eA eAcBcAdBcAaBaAaEaDaDaCbA bAbDbCbCaBcAcAbDcCDbCbBbBdAdDdDcCcBC17142128020406080100120140SL-Ba/MSL-Ba/YSL-Ba/M+YcAbBbBaAaBaBbAbBcBdAcCdBdAdCeB图 3 发酵乳在冷藏期间的活菌数Fig.3 Viable bacteria count of fermented milkduring refrigeration 第 44 卷 第 18 期潘坤，等：动物双歧杆菌联合传统发酵剂对发酵牛乳、牦牛乳品质的影响 185 于 SL/Y 组。在发酵混合乳组中，SL-Ba/M+Y 组的蛋白水解活力在 1 d 时显著高于 SL/M+Y 组（P0.05），推断动物双歧杆菌在发酵混合乳中的蛋白代谢活动仅在冷藏初期较强。171421280.100.150.200.25A340 nm冷藏时间(d)cDdCcCbAcCbBbDcBaAaAbBbBbCbABaAaAaABaBaBCaAbCabAbBCabBaBaAbCDcDbCDabCSL/MSL-Ba/MSL/YSL-Ba/YSL/M+YSL-Ba/M+Y图 5 发酵乳在冷藏期间的蛋白水解活力Fig.5 Proteolytic activity of fermented milkduring refrigeration 2.5流变特性储能模量（G）也称弹性模量，表示当物体受到外力作用时的形变程度，可以反映样品弹性形变能力的大小；G越大说明物体受到外力作用时的形变程度越小。损耗模量（G）也称黏性模量，表示物体受到外力作用时阻碍其流动的特性，可以一定程度上反映样品的黏性；G越大说明物体受到外力作用时越不容易流动29。从图 6 可以看出，各组发酵乳的 G都大于G，说明发酵乳的网络结构稳定，能够承受高频率的破坏，表现的更像固体12。随着冷藏时间的增加，SL/M 组、SL-Ba/M 组、SL/Y 组的 G和 G上升；SL-Ba/Y组的 G和 G无明显变化；SL/M+Y 组 G和 G下降；SL-Ba/M+Y 组的 G、G上升。SL/M+Y 组随着冷藏时间的增加，受到外力作用时，更容易发生形变，更容易流动，变得更像液体，其余五组都变得越来越稳定，越来越像固体。后酸化能够促进酪蛋白颗粒不断融合，提升发酵乳的稳定性30，因此可以推断动物双歧杆菌在发酵混合乳中能够促进发酵乳后酸化过程中酪蛋白颗粒的融合。SL/Y 组在 28 d 表现出过高的G、G，推测是大量乳清析出，导致发酵乳凝乳结块。其中 SL-Ba/Y 组的 G、G低于 SL/Y 组，但是高于SL/M 组、SL-Ba/M 组、SL/M+Y 组、SL-Ba/M+Y组，这表明其凝胶结构更多，因此会表现出更加厚重的口感31。2.6物理稳定性不稳定指数可以衡量乳液的稳定性。在相同条件下，不稳定指数越接近于 1，说明发酵乳分离越快，发酵乳越不稳定32。由表 2 可知，SL/M 组各相邻冷藏期无显著变化（P0.05），但 2128 d 相比 17 d 有显著下降（P0.05）。SL-Ba/M 组的不稳定指数在1421 d 显著下降（P0.05）。SL/Y 组不稳定指数先增加后显著下降（P0.05），于 14 d 达到最大值。SL-Ba/Y组不稳定指数在 17 d 增加（P0.05）。SL/M+Y 组在 2128 d 下降（P0.05）。SL-Ba/M+Y 组不稳定指数在各相邻冷藏期无显著变化（P0.05），但21 d 对比 7 d 有显著下降（P0.05），推断动物双歧杆菌对发酵乳的不稳定指数影响不大。发酵牦牛乳组的不稳定指数显著高于发酵牛乳组（P0.05），原因是发酵乳中酪蛋白表面大部分带有正电荷，在酸性条件下会相互聚集33，而牦牛乳中酪蛋白的含量显著高于牛乳5，更容易聚集成团，形成沉淀。2.7微观结构凝固型发酵乳具有三维网状结构，且这种网状纤维中间有无数大小不一且呈六棱形的空隙，乳脂肪 表 2 发酵乳在冷藏期间的不稳定指数Table 2 Instability index of fermented milk during refrigeration冷藏时间（d）组别SL/MSL-Ba/MSL/YSL-Ba/YSL/M+YSL-Ba/M+Y10.7280.097aBC0.6730.041aC0.8090.009bAB0.8230.015bA0.8250.006aA0.7870.007abAB70.7070.015aBC0.6630.148aC0.8090.014bAB0.8470.005aA0.7460.026abABC0.8150.017aAB140.6770.146abB0.6530.070aB0.8530.013aA0.8340.017abA0.7170.111abAB0.7660.033abAB210.5440.057bcC0.4890.045bC0.8490.005aA0.8520.002aA0.8080.016aA0.7290.050bB280.4900.002cD0.4970.008bD0.8150.002bAB0.8440.006aA0.6430.055bC0.7620.062abB注：同列肩标不同小写字母表示不同冷藏时间差异显著（P0.05），同行肩标不同大写字母表示不同处理样品差异显著（P1 和累计贡献率70%的物质种类作为主成分39。由图 8 可知，发酵乳挥发性风味物质有三个主成分，第一主成分（PC1）贡献率为 34.958%，构成成分是醛类、酮类、烃类；第二主成分（PC2）贡献率为 24.297%，构成成分是醇类和其他；第三主成分（PC3）贡献率为 20.979%，构成成分是醇类和酯类。由图 9 可以看出，不同发酵乳在不同发酵时间在得分上具有差异。在第 1 d，发酵底物相同的组得分接近。SL/M 第 28 d 和 SL/M+Y 第14 d 在第一主成分上得分较高；SL/M 第 1 d 和 SL-Ba/M 第 1 d 在第二主成分上得分较高；SL/M 第 28 d和 SL-Ba/Y 第 28 d 在第三主成分上得分较高。不同冷藏时间的发酵乳关键风味贡献物质结果以热图表示。发酵乳中共确定 30 种关键风味物质（ROAV1）。随着冷藏时间的增加，SL/M 组关键风味物质种类逐渐减少，而 SL-Ba/M 组数量保持恒定；SL/Y 组关键风味物质在