大鼠血清尿酸液相色谱-紫外检测新方法的建立及比较研究.pdf

建立更准确、灵敏的液相色谱紫外（liquid chromatography-ultraviolet，LC-U V）检测大鼠血清尿酸的方法，并将该方法与市售试剂盒的检测结果进行比较，为氧嗪酸钾诱导的大鼠高尿酸血症模型中血清尿酸含量的准确测定提供新方法。方法采用向SPF级雄性SD大鼠腹腔注射氧嗪酸钾（30 0 mg/kg）的方法建立高尿酸血症大鼠模型，对照组给予等量的0.5%羧甲基纤维素钠溶液。经眼眶后静脉丛采血，离心获得大鼠血清样品，经0.1%三氟乙酸-乙腈（含内标3，4-二羟基苄胺氢溴酸盐）沉淀后，取上清液进样分析。采用WatersXBridgeHILIC色谱柱（15 0 mm4.6mm，3.5 m）对尿酸进行分离，使用乙腈（含0.5%甲酸与2 mmol/L甲酸铵）作为有机相，甲醇溶液（甲醇：水=1：1，含0.5%甲酸与2 mmol/L甲酸铵）作为水相，进行等度洗脱，于2 90 nm波长处进行检测。使用活性炭处理的血清样品作为空白生物基质，用于方法学验证。分别使用所建立的LC-UV方法与两种市售试剂盒（尿酸酶法和磷钨酸法）检测高尿酸血症模型大鼠的血清尿酸水平，并对3种检测方法的准确度进行比较。结果大鼠血清中的尿酸在10 2 0 0 g/mL质量浓度内线性关系良好（R0.999），定量下限为10 g/mL，准确度为-2.17%2.2 1%，批内精密度为0.5 2%1.95%，批间精密度为3.0 4%4.90%，提取回收率为8 3.12%8 9.91%。在氧嗪酸钾诱导的大鼠高尿酸血症模型中，市售的磷钨酸法试剂盒测定结果显著高于LC-UV法测定结果，市售的尿酸酶法试剂盒测定结果显著低于LC-UV法测定结果，但LC-UV方法的加样回收率结果最佳（9 5.9 0%9 9.9 6%）。结论所建立的LC-UV方法能够准确测定大鼠血清中尿酸含量，与市售试剂盒相比具有更高的准确度，推荐作为氧嗪酸钾诱导的大鼠高尿酸血症模型中血清尿酸含量的检测方法。【关键词 尿酸；液相色谱；内标法；高尿酸血症；大鼠中图分类号】R-332；Q 9 5-33 文献标志码 A文章编号 16 7 4-5 8 17(2 0 2 3)0 3-0 314-0 9Quantification of Uric Acid of Rat Serum by Liquid Chromatography-ultraviolet Detection and Its Comparison StudyXIA Ziyin,CHAI Yuanyuan,XU Yunxia,YU Qinwei,HUANG Xin,ZHANG Luyong,JIANG Zhenzhou!(1.New Drug Screening Center,Jiangsu Center for Pharmacodynamics Research and Evaluation,State KeyLaboratory of Natural Medicines,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China;2.Center for DrugResearch and Development,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China)Correspondence to:ZHANG Luyong(ORCID:0000-0003-1164-7371),E-mail:;ABSTRACT Objective To establish a more accurate and sensitive liquid chromatography-ultraviolet(LC-UV)method for the determination of uric acid in rat serum,and compare the results with those ofcommercial kits,providing a new method for the accurate determination of uric acid in the rathyperuricemia model induced by potassium oxonate.Methods A hyperuricemia model was established byintraperitoneal injection of potassium oxonate(300 mg/kg)into SPF-grade male SD rats,and the control第一作者】夏子茵（1997 一），女，硕士，研究方向：药代与靶向代谢组学。E-mail:。O R CID：0 0 0 0-0 0 0 3-0 6 6 0-5 2 14通信作者】张陆勇（196 2 一），男，博士，教授，研究方向：新药筛选及早期成药性评价和分子毒理学。E-mail:。O R CID：0000-0003-1164-7371;江振洲(197 6 一)，男，博士，研究员，研究方向：药源性肝脏毒性及其分子机制、代谢动力学物质基础研究。E-mail:。O R CI D:0 0 0 0-0 0 0 2-0 42 0-0 8 2 2实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicineJIANG Zhenzhou(ORCID:0000-0002-0420-0822),E-mail:Jun.2023,43(3)动物实验技术与方法Animal Experimental Techniques and MethodsJun.2023,43(3)group was administered an equal amount of 0.5%sodium carboxymethylcellulose solution.Blood sampleswere collected from the posterior orbital venous plexus and centrifuged to obtain serum samples.Afterprecipitation with 0.1%trifluoroacetic acid-acetonitrile(containing the internal standard 3,4-dihydroxybenzylamine hydrobromide),the supernatant was injected for analysis.Uric acid was separatedon a Waters XBridge HILIC column(150 mm4.6 mm,3.5 m)using acetonitrile(containing 0.5%formic acidand 2 mmol/mL ammonium formate)as the organic phase and methanol solution(methanol:water=1:1,containing 0.5%formic acid with 2 mmol/L ammonium formate)as the aqueous phase for isocratic elutionand detection at 290 nm.Serum samples treated with activated carbon were used as substitute matricesfor the methodological verification.Serum uric acid levels in rats with potassium oxonate-inducedhyperuricemia were measured using the established LC-UV method and commercially available kits(uricase and phosphotungstic acid methods),and the accuracies of the three methods were compared.Results Serum uric acid showed a good linear relationship(R0.999)at mass concentration of 10-200 g/mL in rats,the lower limit of quantification was 10 g/mL,the accuracy ranged from-2.17%to 2.21%,theintra-batch precision ranged from 0.52%to 1.95%,the inter-batch precision ranged from 3.04%to 4.90%,and the extraction recovery ranged from 83.12%to 89.91%.In the rat model,the results obtained using thecommercially available phosphotungstic acid method kit were significantly higher than those of the LC-UVmethod,and those obtained using the commercially available uricase method kit were significantly lowerthan those of the LC-UV method,but the LC-UV method showed the best recovery of the spiked sample(95.90%-99.96%).Conclusion The LC-UV method developed in this study can determine the concentrationof uric acid in rat serum with higher accuracy than commercially available kits and is recommended for thedetermination of serum uric acid in the rat model of hyperuricemia induced by potassium oxonate.Key words Uric acid;Liquid chromatography;Internal standard method;Hyperuricemia;Rats实验动物与比较医学LaboratoryAnimaland ComparativeMedicine315尿酸作为嘌呤代谢的终产物，是临床诊断痛风、肾结石的传统生化指标 1-2 。尿酸在人体功能中起着至关重要的作用，尿酸水平过高会引发一系列疾病。研究发现，高尿酸与非酒精性脂肪肝 3-4、高血压 5 、动脉粥样硬化 6 、静脉血栓栓塞 7 、代谢综合征 8-9等密切相关。高尿酸血症对身体多种脏器都可产生损害，如关节损伤、肾脏损伤、心血管损伤等【10 。高尿酸血症动物模型的建立是高尿酸血症临床前研究的关键工具，其中常用的就是氧嗪酸钾诱导的大鼠高尿酸血症模型 ，血清尿酸含量又是该模型的关键性指标。有效降低尿酸水平是降低痛风发生风险及预防并发症的关键。因此，准确测定血尿酸水平对监测高尿酸血症的发生、发展及临床前研究至关重要。目前，尿酸的检测方法主要有试剂盒检测法与液相色谱法，其中试剂盒的检测原理主要分为尿酸酶法和磷钨酸法【12】，然而血清中许多内源性物质可能干扰尿酸酶法和磷钨酸法的测定，使测量结果出现偏差【13。高效液相色谱法经过样品前处理，利用样品中各组分在色谱柱中固定相和流动相间分配系数或吸附系数等差异，将各组分分离后进行定量分析，具有很好的专属性【14。因此，本研究将建立液相色谱-紫外(liquid chromatograph-ultraviolet，LC-U V）检测方法，并与市售的尿酸酶法、磷钨酸法试剂盒比较，用于测定高尿酸血症模型大鼠的血清尿酸含量，以期为血清尿酸的准确检测提供参考。1材料与方法1.1药品与试剂尿酸标准品（纯度99%，批号BCCC8658）和3，4-二羟基苄胺氢溴酸盐（3，4-dihydroxybenzylaminehydrobromide，D H BA）标准品（纯度98%，批号MKBS7646V）均购自德国SigmaAldrich公司；氧嗪酸钾（批号YQ34L-LA）购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulosesodium，CM C-Na，批号2 0 17 0 8 10）购自国药集团化学试剂有限公司；三氟乙酸（色谱纯）购自美国TEDIA公司；甲醇、乙和甲酸均为色谱纯，购自德国Merck公司；尿酸检测试剂盒（酶比色法，批号2 0 2 10 8 31)和尿酸检测试剂盒（磷钨酸比色法，批号2 0 2 10 0 8 0 7)均购自南京建成生物工程研究所有限公司。1.2仪器LC-20AD色谱泵、SIL-20AC自动进样器、CBM-20A连接器和SPD-20A紫外吸收检测器均为日本Shimadzu公司产品；色谱柱（货号18 6 0 0 4441）购自沃316特世科技（上海）有限公司；HT-220A柱温箱为中国天津市恒奥科技发展有限公司产品；SartoriusQUINTIX125D-1CN天平（精度0.0 1mg）为德国Sartorius公司产品；LegendMicro21R低温离心机和GenPure UV-TOC/UF xCAD plus 自动纯水机为美国ThermoFisherScientific公司产品。1.3实验动物SPF级雄性SD大鼠12 只，体质量16 0 18 0 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司 SCXK（沪）2 0 17-0005，实验动物质量合格证编号为2 0 17 0 0 0 5 0 6 5 6 98。动物饲养于中国药科大学药学动物实验中心【SYXK（苏）2 0 2 1-0 0 11，实验期间动物自由进食、饮水，12h/12h昼夜节律正常。动物实验方案经中国药科大学伦理委员会审核批准（2 0 2 1-0 9-0 2 5）。1.4高尿酸血症大鼠模型的建立12只SPF级雄性SD大鼠在实验前适应性饲养1周。将SD大鼠随机分为对照组和氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症组，每组6 只，禁食12 h。高尿酸血症组腹腔注射氧嗪酸钾（30 0 mg/kg），对照组给予等量的0.5%CMC-Na溶液。给药完毕后，动物结束禁食。分别于氧嗪酸钾给药前及给药后1h，经眼眶后静脉丛采血5 0 0 L于1.5mL离心管中，所得血样经35 0 0 Xg离心10 min得血清样品。1.5LC-UV检测1.5.1房尿酸及DHBA标准品溶液的配制尿酸标准品溶液的制备：精密称定尿酸标准品，用0.0 1mol/L氢氧化钠溶液溶解并定容，配制质量浓度为1mg/mL的尿酸标准品溶液。DHBA标准品溶液的制备：精密称定DHBA标准品，用甲醇溶解并定容，配制质量浓度为1mg/mL的内标标准品溶液。1.5.2月尿酸标准曲线样品及质控样品工作溶液的配制取尿酸1mg/mL的标准品溶液，用甲醇稀释制备质量浓度分别为10、2 5、5 0、8 0、10 0、12 0、16 0、200g/mL的尿酸标准曲线样品工作溶液，以及质量浓度分别为2 5、10 0、16 0 g/mL的质控样品工作溶液。1.5.3空白生物基质的制备取实验室前期收集的经眼眶后静脉丛采血所得空白雄性SD大鼠血清样品，每1mL血清加人15 0 mg活性炭，涡旋振荡30 min后离心（140 0 0 xg，15 mi n），取上清液。该过程重复两次后即可得到无尿酸的空白血清样品。实验动物与比较医学Laboratory Animal andComparativeMedicine1.6.3准确度和精密度按照“1.5.2”项下描述配制尿酸质控样品工作溶液，分别吸取5 0 L于1.5 mL离心管中，氮吹仪挥干溶剂，加人5 0 L空白生物基质，混匀后按照“1.5.4”项下描述处理上述血清样本。为考察批内和批间差异，3个浓度均平行制备5 份，并连续测定3个分析批次。准确度用相对误差（relativeerror，R E）表示；精密度用质控样品的批内和批间相对标准偏差（relativestandard deviation，R SD）表示。Jun.2023,43(3)1.5.4样品前处理取12 只雄性SD大鼠的血清5 0 L，加入2 5 0 L0.1%三氟乙酸-乙腈（含内标DHBA70g/mL），涡旋振荡后离心（140 0 0 Xg，10 mi n）；取上清液2 5 0 L，加入5 0 L超纯水，涡旋振荡后二次离心（140 0 0 g，10min)；取上清液2 5 0 L，进样分析。1.5.5色谱分析条件色谱柱为WatersXBridgeHILIC（4.6 mm15 0 mm，3.5m）。流动相水相为甲醇溶液（甲醇和水体积比为1：1，含0.5%甲酸和2 mmol/mL甲酸铵），有机相为乙腈（含0.5%甲酸和2 mmol/mL甲酸铵）。采用等度洗脱，水相与有机相的体积比为1：9，流速为0.5 mL/min，进样体积为10 L，柱温为40，自动进样器温度为4，检测波长为2 90 nm。1.6方法学验证根据药物非临床药代动力学研究技术指导原则(https:/ 专属性分别取SD大鼠的空白生物基质、加人了尿酸的空白生物基质、正常大鼠血清，按照“1.5.4”项下样品前处理方法，考察方法的专属性，以确认内源性物质在尿酸和DHBA的保留时间内有无干扰。1.6.2标准曲线按照“1.5.2”项下描述配制尿酸标准曲线样品工作溶液，分别吸取5 0 L于1.5 mL离心管中，氮吹仪挥干溶剂，加入5 0 L空白生物基质，混匀后按照“1.5.4”项下描述处理上述标准血清样本。以尿酸与内标DHBA的峰面积比为纵坐标，以相应质量浓度为横坐标，使用加权最小二乘法进行回归分析，制作标准曲线。Jun.2023,43(3)1.6.4定量下限按照“1.5.2”项下描述配制质量浓度为10 g/mL的尿酸工作液，吸取5 0 L于1.5 mL离心管中，氮吹仪挥干溶剂，加人5 0 L空白生物基质，混匀后按照“1.5.4”项下描述处理。平行制备5 份，连续测定3个分析批次。1.6.5提取回收率通过比较空白生物基质分别在提取前和提取后加入尿酸标准品的峰面积比，评价尿酸在3个质控浓度下的提取回收率，确定其结果的精密度和可重现性。1.6.6稳定性按照“1.5.2”项下描述配制尿酸质控样品工作溶液，分别吸取5 0 L于1.5 mL离心管中，氮吹仪挥干溶剂，加人5 0 L空白生物基质，混匀。分别考察其在4自动进样器中放置2 5 h、一2 0 条件冻融3次、室温放置4h、一2 0 条件下放置1周、8 0 条件下放置4周的稳定性，以确定生物样品的存放条件和时间。1.7试剂盒检测及3种方法比较采用尿酸酶法和磷钨酸法两种市售试剂盒测定大鼠血清样本中尿酸含量，测定流程按照试剂盒说明书进行。尿酸酶法试剂盒检测出的尿酸浓度单位为mol/L,而磷钨酸法试剂盒与本研究建立的LC-UV方法测出的尿酸单位为g/mL，3种方法比较时将LC-UV方法与磷钨酸法所测的尿酸浓度单位统一换算为mol/L。为验证LC-UV方法检测血清尿酸含量的准确性，比较了LC-UV检测方法和市售试剂盒（尿酸酶法和磷钨酸法）检测高尿酸血症组大鼠给药前与给药后1h血清样品中的加样回收率。在已知浓度的大鼠血清中加人定量的对照品，按照LC-UV法、尿酸酶法与磷钨酸法的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值即为加样回收率。为避免超出两种试剂盒的检测限值，加样质量浓度分别设置为10 g/mL和2 5 g/mL。1.8数据处理与统计方法采用SPSS23.0软件进行统计分析。两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验。以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1方法学验证结果2.1.1专属性如图1AB所示，尿酸和内标DHBA均具有良好实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicine于LC-UV法(t=4.843，P0.999。标准曲线如图2 所示。2.1.3准确度、精密度和定量下限如表1所示，尿酸在质控浓度的准确度（以RE表示）在一2.17%2.2 1%，批内精密度（以RSD表示）在0.5 2%1.95%，批间精密度（即RSD）在3.0 4%4.90%。尿酸测定的定量下限质量浓度为10 g/mL。尿酸在定量下限的准确度（以RE表示）为一1.9 9%，批内和批间的精密度（以RSD表示）分别为2.42%和5.07%。2.1.4提取回收率和稳定性如表1所示，该方法在3个质控浓度的提取回收率在8 3.12%8 9.91%，其精密度（以RSD表示）均小于15%。质控样品在稳定性验证所考察的各种条件下，RE均小于15%。2.2大鼠血清尿酸含量如图3A所示，采用LC-UV法对比检测对照组和高尿酸血症组大鼠在给药前与给药后1 h的血清尿酸水平，可以看出给药前两组血清尿酸水平差异无统计学意义（t=一1.314，P=0.218），但是给药1h后高尿酸血症组血清尿酸水平显著高于对照组（t=一5.5 14，P0.001），同时也显著高于给药前（t=一13.0 7 4，P0.9994080质量浓度/(g:mL)LC-UV法、磷钨酸法、尿酸酶法这3种方法检测血清尿酸的原理、特点及局限性比较如表3所示。3讨论120160200目前，尿酸的检测方法主要有试剂盒法与高效液相色谱法，其中试剂盒的检测原理主要分为尿酸酶法和磷钨酸法。尿酸酶法的检测原理是尿酸在尿酸酶的作用下生成尿囊素、二氧化碳和过氧化氢，过氧化氢进而与显色剂反应显色 15 。然而造模剂氧嗪酸钾是尿酸酶的抑制剂，可能会抑制反应试剂中尿酸酶的活性，导致检测结果偏低。磷钨酸法的检测原理是尿酸在碱性溶液中与磷钨酸反应生成尿囊素、二氧化碳以及钨蓝，钨蓝的生成量与尿酸含量成正比，可进行比色测定【16 。然而，磷钨酸法特异性差，易受其他还原性物Jun.2023,43(3)表1尿酸检测的批内/批间准确度、精密度、提取回收率以及稳定性Table 1 Intra-and inter-batch accuracy and precision,extraction recovery and stability test of uric acid determination批内准确度和精密度批间准确度和精密度尿酸质Intra-A&P/%量浓度(n=5)p/(g.mL1)1025100160注：A&P为准确度和精密度，用相对误差（RE）表示准确度，用质控样品的批内和批间相对标准偏差（RSD）表示精密度；FTC为冻融条件；RT为室温条件。Note:A&P,accuracy and precision;RE,relative error;RSD,relative standard deviation;FTC,freeze-thaw cycles;RT,room temperature.实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicine稳定性Inter-A&P/%Extraction recovery/%(n=15)(n=5)RERSD-1.992.42-2.171.950.741.542.210.52A500400300200100Timeafteradministration/h319提取回收率Stability(RE)/%4FTCRERSD-3.675.07-3.684.901.153.04-0.563.67#01RTRSD(n=5)89.914.555.0684.421.611.9083.125.636.77BCON300HUA200100t-PTA-20(n=5)(n=3)-3.12-2.19-2.48-2.23-5.46-4.57C600400200t-PTA-80(n=3)(n=3)-11.47-1.09-6.85-5.01-8.41-6.74AAAAn-OT-9.51-14.51-12.76(n=3,x s)Kit-enzyme注：A，LC-U V法检测两组大鼠给药前和给药后1h的血清尿酸浓度（CON，给予0.5%CMC-Na溶液的对照组；HUA，腹腔注射30 0 mg/kg氧嗪酸钾的高尿酸血症组。与CON组相比，*P0.001；与给药前相比，#P0.001。n=6)。B C，给药前和给药后1h三种方法测定的血清尿酸浓度比较（LC-UV，液相色谱-紫外检测法；Kit-PTA，磷钨酸法试剂盒；Kit-enzyme，尿酸酶法试剂盒。与LC-UV法相比，P0.05,P0.01,P0.001。n =6)。Note:(A)LC-UV method was used to detect the serum uric acid concentration of rats in the two groups before and 1 h after administration(CON,control group administered 0.5%CMC-Na solution;HUA,hyperuricemia group administered 300 mg/kg potassium oxyzate).Compared with the CON group,*P0.00 1;Compared to before administration,*#P0.001.n=6).(B-C)Serum uric acid concentration wasmeasured using three methods before and 1 h after administration(LC-UV,liquid chromatography-ultraviolet;Kit-PTA,phosphotungstic acidmethod Kit;Kit-enzyme,uricase method Kit.Compared with LC-UV,P0.05,P0.01,P0.00 1.n=6).图3给药前与给药后1h大鼠血清尿酸含量Figure 3 Determination of serum uric acid concentrations in rats before and 1 h after administration表2 LC-UV法与市售试剂盒检测的加样回收率比较Table 2 Comparison of the spiked recovery of LC-UV method and commercially available kits加样回收率/%取样时间/h加样质量浓度/(g-mL-1)Time/hp/(g:mL)0a10251a1025注：LC-UV，液相色谱-紫外检测法；Kit-PTA，磷钨酸法试剂盒；Kit-enzyme，尿酸酶法试剂盒。a，LC-U V法测定HUA组给药前和给药后1h血清尿酸质量浓度分别为2 1.2 1g/mL和5 0.7 1g/mL。Note:LC-UV,liquid chromatography-ultraviolet detection;Kit-PTA,phosphotungstic acid method;Kit-enzyme,uricase method.a,Theconcentrations of uric acid in serum before and 1 h after administration were 21.21 g/mL and 50.71 g-mL by LC-UV.Kit-enzymeRecovery of spiked samples/%磷钨酸法LC-UVKit-PTA99.976.86118.8321.2295.904.54117.908.4898.183.23125.00 5.3499.640.99112.963.85尿酸酶法Kit-enzyme60.0511.284.314.3127.378.6243.555.38320表3LC-UV法与磷钨酸法、尿酸酶法检测血清尿酸含量的比较Table 3 Comparison of liquid chromatography-ultraviolet(LC-UV)method with phosphotungstic acid method and uricasemethodfordeterminingserumuric acid检测方法Method磷钨酸法Phosphotungsticacid method液相色谱-紫外检测法LC-UV尿酸酶法Uricase method质（如谷胱甘肽、抗坏血酸）的影响【12 。在反应过程中，还原物质会增加显色产物的含量，导致检测结果高于真实值。而在高效液相色谱法中，溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而能实现对待测组分的分离，因此，高效液相色谱具有专属性强、准确度高的特点。本研究中3种检测方法的加样回收率表明，在氧嗪酸钾诱导的大鼠高尿酸血症模型中，尿酸酶法与磷钨酸法的准确度均低于LC-UV检测方法，因此在该模型中建议采用更准确、可靠的LC-UV分析方法来检测高尿酸血症大鼠模型的血清尿酸水平。根据药物非临床药代动力学研究技术指导原则中生物样品分析方法的基本要求，专属性考察结果表明LC-UV检测方法的专属性良好，标准曲线结果表明LC-UV检测方法所测尿酸在10 2 0 0 g/mL范围内有良好的线性关系。上述指导原则中要求准确度的验收标准为RE在+15%内，精密度的验收标准为RSD小于AHHNZ图4尿酸(A)与DHBA(B)的结构式Figure 4 Structures of uric acid(A)and 3,4-dihydroxy-benzylamine hydrobromide(DHBA)(B)实验动物与比较医学Laboratory Animal andComparativeMedicine原理Principle尿酸在碱性溶液中与磷钨酸反应,生成尿囊素、二氧化碳和钨蓝，钨蓝的生成量与尿酸含量成正比溶于流动相中的各组分经过固定相时，专属性强，准确度高，线性范围广，成本较高、检测时间较长由于与固定相发生作用的大小不同，导致其保留时间不同尿酸在尿酸酶的作用下生成尿囊素、二氧化碳和过氧化氢，过氧化氢与显色剂反应显色BOJun.2023,43(3)特点局限性FeaturesLimitations操作简单，检测时间短，成本低，可特异性差，准确度低，检测结果易受血清用于自动化分析色谱柱可反复使用操作简单，检测时间短，成本低，可尿酸酶的活性易被血清中氧嗪酸钾抑用于自动化分析15%，定量下限的验收标准为RE在2 0%内、RSD小于2 0%。本研究结果表明，LC-UV检测方法的质控浓度与定量下限准确度和精密度良好，符合样品分析要求；而且LC-UV检测方法的提取回收率稳定，质控样品在考察条件下稳定性良好，能够满足测定需求。因此，本研究建立的LC-UV法专属性、标准曲线、准确度、精密度、定量下限、提取回收率及稳定性的考察结果均符合方法学验证要求。在已报告的尿酸LC-UV检测方法中，反相C18柱是最常用的色谱柱。由于尿酸极性大（尿酸结构式见图4A），使用常规的反相色谱柱保留时间短，为了延长尿酸保留时间需要使用高比例的水相，然而高比例水相会影响色谱柱的使用寿命。Zhao 等 17 建立了一种LC-UV方法检测血浆与尿中的肌酐与尿酸，该方法使用了C18柱与高比例的水相作为流动相，尿酸的出峰时间仅在3min左右，保留时间短，易被血清中的内源性物质干扰测定。Waters XBridgeHILIC是未键合的亚乙基桥杂化颗粒色谱柱，HILIC是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术，通过采用强极性固定相，并且结合高比例有机相/NH2低比例水相组成的流动相来实现这一目的【18 。本研究采用HILIC柱与90%的有机相等度洗脱进行尿酸含量HBr分析，对色谱柱的使用寿命没有损害，对尿酸有较好的保留。OH在采用质谱为检测器的尿酸检测方法中，同位素OH内标是最常用也是最为理想的 19，但由于分离能力有限，同位素内标并不适用于LC-UV检测。在部分已发表的文献中并未选用合适的内标用于尿酸含量的LC-UV测定 17.2 0 。本研究在方法摸索过程中筛选了尿酸中其他还原性物质影响制,准确度低Jun.2023,43(3)的结构类似物5-氟尿嘧啶、DHBA等，其中DHBA与尿酸的结构存在部分相似（DHBA与尿酸的结构式见图4），均具有芳香环结构，能够与尿酸实现很好的分离，并且其出峰稳定，响应良好，无内源性物质干扰。因此，本研究选择DHBA作为血清尿酸含量测定的内标，为尿酸LC-UV检测方法的建立提供了参考。另外，尿酸作为维持人体健康的内源性生物活性分子，在LC-UV测定中常缺乏真实的空白生物基质来制备标准曲线。Wen等 15 采用LC-UV法检测血清中尿酸含量，并与常规的尿酸检测方法（尿酸酶法和磷钨酸法）进行了对比，但该方法未使用空白生物基质，基质中存在的内源性干扰对测定的影响不明。本研究选择了活性炭处理过的血清作为空白基质，结果证实其在尿酸和内标的保留时间窗口中无明显内源性干扰，不影响尿酸的测定。综上所述，本研究建立的LC-UV法与之前已报告的LC-UV法相比，主要有如下优势：（1）本方法选用了HILIC柱与高比例有机相洗脱进行尿酸含量分析，不仅对色谱柱的使用寿命没有损害，而且对尿酸有较好的保留；（2）本方法为尿酸的LC-UV检测选择了一个合适的内标，使用内标法定量更加准确；（3）本方法选择了活性炭处理过的血清作为尿酸含量测定的空白生物基质，检测结果更加准确。与此同时，本方法也存在一些不足：（1）HILIC色谱柱需要较长的平衡时间才能有稳定的基线和色谱峰保留 2 1，导致每批分析时间较长，有待进一步优化；（2）本方法目前仅用于动物模型中尿酸的检测，是否适用于人类血尿酸含量的测定尚需进一步验证。本研究表明，在氧嗪酸钾诱导的大鼠高尿酸血症模型中，尿酸酶法与磷钨酸法的准确度均低于LC-UV法，本研究所建立的LC-UV法能够更加准确、可靠地测定氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症模型大鼠的血清尿酸含量。医学伦理声明MedicalEthicsStatement本研究涉及的所有动物实验均已通过中国药科大学伦理委员会批准（审批号：2 0 2 1-0 9-0 2 5）。所有实验过程均遵照中国实验动物相关法律法规条例要求进行。All animal experiments in this study were approved by theEthics Committee of China Pharmaceutical University(Approval Letter No.2021-09-025).Allexperimentalprotocols followed the guidel