亲和毛细管电泳技术及其应用.pdf

文献综述亲和毛细管电泳技术及其应用王京兰钱小红（军事医学科学院国家生物医学分析中心 北京 1 0 0 8 5 0）提要对近几年新发展起来的亲和毛细管电泳技术(A C E)的原理、分类及方法作了简要介绍，着重介绍了亲和毛细管区带电泳、毛细管亲和凝胶电泳、胶束电动色谱中的亲和电泳、亲和毛细管等电聚焦、亲和探针毛细管电泳等过程和方法。对 A C E在分子生物学、生物化学中的应用及该技术在亲和常数测定、核酸片段识别、竞争免疫分析、药物先导化合物的筛选等方面的应用也作了介绍。关键词毛细管电泳，亲和毛细管电泳，蛋白质，核酸分类号O6 5 81 前 言亲 和毛 细管 电泳(a f f in it y c a p i ll a r y e le c t r o-p h o r e s i s,A C E)是指在电泳过程中具有生物专一性亲 和 力 的 两 种 分 子受 体(r e c e p t o r)和 其 配 体(l ig a n d)间，发生了特异性相互作用，形成了受体 配体复合物，通过研究受体或配体在发生亲和作用前后的电泳谱图变化，可获得有关受体-配体亲和力大小、结构变化、作用产物等方面的信息。多种毛细管电泳模式 中均可引入亲和机制。目前亲和毛细管电泳技术已用于研究各种类型的配体-受体相互作用，测定其亲和常数。通过改善被分析物的电泳迁移行为，可提高分离分辨率和分析灵敏度。本文仅就 A C E的原理及其应用进展作一介绍。2 各种 A C E的原理及方法2.1 以毛细管区带电泳为基础的 A C E在毛细管区带电泳中，被分析物的电泳淌度 与其质量m和所带电荷z 有关:o c z/m 2/3。在电泳缓冲液中加入被分析样品的带电亲和配体时，样品进入缓冲体系和配体发生一定程度 的相互作用，改变了样品的质量和电荷，导致了电泳淌度的变化。根据样品在配体加入前后的迁移时间变化可判断样品与配体是否发生了亲和相互作用，并可估计亲和力的大 小 1,2。这种 方式适用于相互作用双方的 结合力较弱、在电泳过程中不断进行着结合与解吸的过程。还可以将亲和配体化学键合到毛细管柱上，制成亲和毛细管柱。亲和毛细管柱增加了分离的选择性，与亲和配体作用力强的样品组分的出峰时间延长了 3 配体对受体淌度变化 的影响，与配体的大小及带电量有关 1,2.4。小配体引起的变化小，带电量大的配体对受体淌度的影响大。配体浓度 L 、配体-受体结合常数 Kb 对受体迁移时间有正性影响，它们的值越大，受体迁移时间的变化就越大。当配体浓度已达到与受体结合的饱和浓度时，再增加配体浓度，受体迁移时间也不会有很大的变化4。对于分离配体和受体反应后的混合物，可通过改变反应时间和反应物浓度来观察配体、受体结合的中间过程。以区带 电泳为基础 的毛细管亲和 电泳操作简单、方便，在测定生物分子相互作用的亲和常数方面有许多优点，如样品用量少，对样品纯度和准确浓度要求不高，可同时测定样品中多个成分与配体作用的亲和统 常 数等测 舛 定亲 缀和统 常 数的般方法是用不同 浓度的配体进行多次试验，根据配体浓度与样品迁移时间或淌度的关系方程来计算结合常数 K b 或解吸常数 K d 2,4 7 。22 毛细管亲 缀和凝胶电 缬泳(C ap i l a ry A ff i n i ty G el E l e c t r o p h o r e s i s,C A G E)亲和凝胶毛细管电泳是将被分析物的亲和配体加 尤 入凝 胶 夯基 质 手中使 二 者 发 生 特 匾 异 性相互 作用改 谋 被分析物的迁移速度。亲和配体加入凝胶基质的方式有 3 种:(a)将配体加入凝胶缓冲液中，形成溶剂化配体，(b)将大配体嵌在凝胶网格 中，(c)直接将配体 化 学 键 合 于 谀 凝 胶 基 质（图l）上 8,9现 以聚乙烯基腺 嘌呤 p o l y(9-v i n y l a d e n i n e)，P V A d为大配体模型来说明 C A G E中配体、受体的相 互 作 用P VAd是 以 聚 乙烯 链 代 替 糖 磷 酸 骨 架 艿 的 聚核昔酸类似物，它能够与碱基互补的天然聚核昔酸通过氢键作用形成复合物。用嵌有 P V A d 大配体的凝胶毛细管可分 离寡核 昔酸 d T和 d A，d T 与本文收稿日 期:1 9 9 8-0 4-2 5，修回日期:1 9 9 8-1 0-1 7P V A d的碱基互补，迁移时间长，在无 P V A d的凝胶毛细管中，二者迁移时间相同（图 2）。随着凝胶中所含 P V A d 浓度的 增加，d T的迁移时间也增加，但同时 也 伴随 峰 形的 展 宽 92.3 胶 束 电动毛 细管 色谱(Mi c e l l a r E l e c t r o k i n e t i cC a p il l a r y C h r o m a t o g r a p h y,M E C C)中的 亲和电泳研究生物大分子（如蛋白）与其亲和配体的相互作用要在非变性环境中进行，在 ME C C中引入亲和机制要考虑去污剂对蛋白活性的影响。k u n 等1 0 研究了 ME C C中生物素结合蛋 白与生物素的结合能力，与区带电泳条件的结果相比较，发现在 S D S存在时，两种蛋白与生物素的结合能力要失去 1 2。2.4 亲和毛细管等电聚焦(C a p i l la r y I s o e l e c t r o f o-c u s i n g,C I E F)C I E F依据被分析物的等电点 的不同来分离蛋白，蛋白与其亲和配体形成复合物时，等电点会发生变化1 1。通过监测等电 点的变化可以获得有关蛋白结构方面的 信息 1 4。这种电 泳操作模式适于分离分析蛋白与配体反应后的混合物。2.5 亲和探针毛细管电泳(A f f i n i ty P r o b e C a p i ll a r yE l e c t r o p h o r e s i s,A P C E)相互作用的生物分子的一方用荧光染色剂标记，此标记分子称为亲和探针，探针与待测样品反应形成动力学稳定的复合物，反应后的混合物经电泳分离及激光诱导荧光检测，可以方便地分辨出 游离探针峰和复 合物峰1 1,1 3 。此方法的检测灵敏度高，亲和探针的用量也少。S h im u r a 等1 1 将鼠 单克隆抗体I g G片段标记为亲和探针用以分析重组人生长因子，检测浓度可达 5 p m o l/L。3 亲和毛细管电泳技术的应用A C E 技术广泛应用于分子生物学和生物化学等研究领域，如核酸片段 的特异性识别、蛋白相互作用、竞争性免疫分析、药物-受体和药物-蛋白作用研究等。此外，A C E也可用于提高毛细管电泳分析灵敏度、选择性和分辨率。3.1 在核酸分析中的应用在凝胶缓冲液中加入溴化乙锭可 以提高 D N A酶片段的电泳分辨率8 溴化乙锭带正电，可嵌入D N A双螺旋链，与核酸片段形成复合物，由于电性效应，改善了核酸片段的分辨率，溴化乙锭还使核酸紫外吸收值增加，提高了分析灵敏度。在凝胶中嵌入聚乙烯基腺嘌呤(P V A d)9,1 4，可以 识别序列特异的核酸片段，能区分普通C G E不能分开的T T T A T T，T T T T A T,T T T T T A这 3 个片段，还可应用于检测癌基因的点突变。3.2 A C E在蛋白分析中的应用3.2.1 肽图分析肽图是蛋白的指纹图，是对蛋白进行鉴定和表征的 有效、重要的手段之一。R u s h 等 16 引 入亲和机制，利用缓冲液中的离子对试剂庚烷磺酸与红细胞生成素的作用，改善了分辨率，所得肽图可区分糖肽和非糖基化肽，至少能分辨出 1 2 个搪肽类型。3.2.2 蛋白微不均一性分析对蛋 白微不均一性的研究，有助于我们对蛋白结构与功能的认识。亲和毛细管电泳的高分辨率有助于识别这种微不均一性。S h im u r a 等 1 1 应用A P C E检测出了重组人生长因子中由于脱氨基数 目 不同而导致的 3 种异构体。R u s h 等1 6 对重组人红细胞生成素糖肽的微不均一性进行了评价。H a u p t 等1 7 以C u 2+螯合物为亲和配体，检测出了糜蛋 白酶组氨酸残基不同而导致的蛋白微不均一性。3.2.3 蛋白-配体相互作用研究及亲和常数测定研究抗原-抗体相互作用的毛细管电泳技术，又称为免疫毛细管电泳。H e e g a a r d 等 18 研究了 抗磷酸酪氨酸单克隆抗体与磷酸酪氨酸的抗原-抗体反应，通过不同抗原浓度下抗体的迁移率变化，计算了解吸常数K d o C h u 等1 9 研究了抗人血清白 蛋白 单克隆抗体与人血清 白蛋白之间的相互作用计算了抗原与抗体的 结合量。抗g a g 蛋白p 2 4 抗体是艾滋病毒(H I V)感染者最初产生的抗体之一，当 H I V感染者发展成为艾滋病患者时，p 2 4 抗体在体内的含量显著减小。Q ia n 等2 0 利用A C E 技术研究了p 2 4 蛋白抗原决定簇与其抗体的结合作用，分析了根据 p 2 4 蛋白抗原决定簇序列合成的一系列 N端,C端截短肽段与抗体的结合作用，找出了亲和最强的肽段。用 A C E还可以进行竞争性免疫分析2 1 23P r P sc 是一种聚集蛋白，得海绵状脑病羊的特征便是脑内 堆积着这 种蛋白的聚集体。S c h n e r r 等 2 1 建立了检测 P r P sc 的竞争性免疫分析方法，选取P r P sc 的 几个肽段，以荧光标记，制备每个肽段的抗体，免疫竟争反应后，用毛细管电泳分离与抗体结合 的标记肽段和游离标记肽段。由 正常羊脑中提取的样品与标记肽段不发生竞争反应，由此可区分正常羊与染病羊。T a o 等 22,2 3 研究了 标记和未标记胰岛素与抗体的结合作用，测定了亲和常数，并对仪器进行改造，制造了一个柱上微量反应装置，可进行在线 自动竞争免疫分析，监测 由葡萄糖和甲苯磺丁脲刺激引起的胰岛素分泌。用 A C E技术还可研究酶与底物、抑制剂的相互作用，毛细管柱可作为一个微量反应器。G o m e z 和C h u 等1,19,2 4 研究了碳酸酐酶B与苯磺酰胺的结合作用、4-烷基苯磺酰胺对碳酸酐酶 B的抑制作用，测定了 结合常数K b o Y o s h im o t o 等 25 将-半乳糖昔酶固定于毛细管柱 内表面，与底物半乳糖昔在柱内发生酶催化反应，从谱图中产物 的峰高可推出反应的初始速度，进而算出反应的动力学常数即米氏常数Km。此方法测 K m 仅耗费微克量的酶及纳克量的底物，远小于传统的亲和色谱测定所需量。一种称为p lu g-p l u g 的反 应方 式，是在一次电泳中 多次 进样，底物和酶依次进入毛细管中，酶的迁移速度比底物快，二者相遇发生酶催化反应，监测产物峰的变化可获得底物与酶作用的 信息2 6 。Z h a o 等2 7 设计了 双酶体系在毛细管内的反应，一个底物两个酶分别进样，底物与酶分别反应，得到不同的产物，通过研究在不同酶浓度 比时产物的数 目和多少，可获得底物与两酶相互关系的信息。对蛋 白与肝素结合的研究也是 A C E技术应用的一个方面。H e e g a a r d 等2 8 结合A C E,H P L C和MS技术，研究了淀粉样蛋白的肝素结合位点序列。蛋白由酶水解为肽片段，肽段经亲和色谱和 A C E分离，得到与肝素结合的肽段，经质谱鉴定为一新的肝素结合序列。H e e g a a r d 2 9 还研究了 乳铁蛋白与肝素的作用，对 比了人奶中和人粒细胞中乳铁蛋 白与肝素的 结合能力。V ic t o r ia 等3 0 制 备了固定化肝素亲和柱来分析酸性成纤维细胞生长因子的肝素结合结构域，用此亲和柱可分开天然构型与结构变异的肽段，二者的差异仅在于一个脯氨酸残基的立体构象不同（天然肽段的脯氨酸残基为 L型，变构肽段脯氨酸残基为 D型）。A C E技术还用于蛋 白与金属离子的结合分析 1 7,3 1 。金属离子属于小配体，对蛋白迁移时间影响不大。为了解决这一问题，H a u p t 等 1 7 将C u 2+整合物共价结合到线性聚合物单甲氧基聚乙烯乙二醇上，制成固定化金属离子亲和配体，得到较好的结果。3.3 A C E在手性分离中的应用分离手性化合物时引入亲和机制可以 提高分辨率。L j u n g b e r g 等1 5 制备的抗 体凝胶柱可分开结构相近的 p-硝基苯标记麦芽糖的和型，提高了分离选择性。牛血清白蛋白(B S A)和环糊精都可作为手性选择剂加入缓冲 液中。B a r k e r 等3 2 分离6 R和6 S甲酰四氢叶酸时，在缓冲液中加入 B S A，使分离效率达到2 0 0 0 0 0 理论塔板数/m，未加B S A时，不能分开这两种异构体。B j o r n s d o t t ir 等 33 用糊精和环糊精作为手性选择剂分离解热镇痛药 I b u p r o f e n的对映异构体及其尿中 的主要代谢产物O H-I b u 和C O O H-I b u的对映异构体，在优化的条件下可以分开这 3 种物质的混合物的所有对映异构体。3.4 A C E在药物研究中的应用多肽类抗生素万古霉素可与细菌细胞壁肽聚糖前体 的末端为 D-A l a-D-A l a的五肽特异性结合，阻止细菌细胞壁的合成。一些细菌可以合成末端结构改变 了的五肽前体，这些五肽与万古霉素的结合力减小，从而使细菌具有耐药性。L i u 等3 4 利用A C E技术比较 了3 种细菌的五肽前体与万古霉素的亲和力大小，并经质谱分析证明，与万古霉素无明显亲和力的两种耐药菌的五肽前体的末端结构为D-A la-D-l a c t a t e。由于新药开发策略的发展，A C E技术还表现出在新药筛选方面的应用前景。传统开发方法是将众多化合物逐个合成与筛选。新的开发策略是直接测试合成化合物的组合库，即从含上百种化合物的混合物中筛选先导药物。C h u 等3 5 利用A C E-M S 技 术建立了从含上百个成分的小肽组合库中筛选万古霉素活性配体的方法。A C E和 MS 技术联用，可以使化合物的筛选和结构鉴定一步完成。4 展望A C E技术的应用范围 日益广泛，在研究生物分子相互作用方面具有快速、微量、简便的优点。在实际应用中，可根据研究 目的不断设计和开发 A C E技术新的用途，进行 仪器部件 的改造，使之成为集反应、分离、鉴定为一体的新型分析工具。参考文献1 A v i l a L Z,C h u Y H,B l o s s e y E C e t a l.J Me d C h e m,1 9 9 3,3 6(1):1 2 6-1 3 32 C h u Y H,A v i l a L Z,B i e b u y c k H A e t a l.J Me d C h e m,1 9 9 2,3 5(1 5):2 9 1 5-2 9 1 73 林 炳承 毛 细 管 电 泳 导论 北 京:科 学出 版社,1 9 9 6.5 4 554 Ku h n R,F r e i R,C h r i s t e n M.An a l B i o c h e m,1 9 9 4,2 1 8(1):1 3 1-1 3 55 L e m e s l e L V,T a v e r n a M.J C h r o m a t o g r A,1 9 9 6,7 3 5(1-2):3 2 1-3 3 16 L i u J,V o l k K J,L e e M S.J C h r o m a t o g r A.1 9 9 4,6 8 0(2):3 9 5-4 0 37 N a d e a u K,N a d l e r S G.B i o c h e m i s t r y,1 9 9 4,3 3(9):2 5 6 1-2 5 6 78 G u t t m a n A,C o o k e N.A n a l C h e m,1 9 9 1,6 3:2 0 3 8-20 4 29 Y o s h i n o b u B.Mo l e c u l a r B i o t e c h n o l o g y,1 9 9 6,6:1 4 3-1 5 31 0 O k u n V M,B i l i t e w s k i U.E l e c t r o p h o r e s i s,1 9 9 6,1 7;1 6 2 7-1 6 3 21 1 S h imu r a K,K a r g e r B L.A n a l C h e m,1 9 9 4,6 6(1):9-1 51 2 O k a n V M.E l e c t r o p h o r e s i s,1 9 9 8,1 9:4 2 7-4 3 21 3 S h i m u r a K,K a s a i K.J C h r o m a t o g r A,1 9 9 4,6 8 0(2):4 0 5-4 1 21 4 Y o s h i n o b u B,T o m o h i r o S,Ak i o K e t a l.E l e c t r o-p h o r e s i s,1 9 9 8,1 9:4 3 3-4 3 61 5 L j u n g b e r g H,O h l s o n S,N i l s s o n S.E l e c t r o p h o r e s i s,1 9 9 8,1 9:4 6 1-4 6 41 6 R u s h R S,D e r b y P L,S t r i c k l a n d T W e t a l.A n a lC h e m,1 9 9 3,6 5(1 4):1 8 3 4-1 8 4 21 7 H a u p t K,R o y F,V i j a y a l a k s b m i M A.A n a l B i o c h e m,1 9 9 6,2 3 4(2):1 4 9-1 5 41 8 H e e g a a r d N H.J C h r o m a t o g r A,1 9 9 4,6 8 0(2):4 0 5-41 21 9 C h u Y H,L e s s W J,S t a s s i n o p o u l o s A e t a l.B i o c h e-m i s t r y,1 9 9 4,3 3(3 5):1 0 6 1 6-1 0 6 2 12 0 Q i a n X H,T o m e r K B.E l e c t r o p h o r e s i s,1 9 9 8,1 9:4 1 5-4 1 92 1 S c h a n e r r M JJ e n n y A.E l e c t r o p h o r e s i s,1 9 9 8,1 9:4 0 9-4 1 42 2 T a o L,K e n n e d y R T.E l e c t r o p h o r e s i s,1 9 9 7,1 8:1 1 2-1 1 72 3 T a o L,A s p i n w a l l C A,K e n n e e d y R T.E l e c t r o p h o-r e s i s,1 9 9 8,1 9:4 0 3-4 0 82 4 Go me z F A,Av i l a L Z,C h u Y H e t a l.An a l C h e m,1 9 9 4,6 6(1 1):1 7 8 5-1 7 9 12 5 Y o s b im o t o Y,S h i b u k a w a A,S a s a g a w a H e t a l.JP h a r m Bio me d An a l,1 9 9 5,1 3(4-5):4 8 3-4 8 82 6 C h u Y H,Av i l a L Z,G a o J M e t a l.A c c C h e m R e s,1 9 9 5,2 8:4 6 1-4 6 82 7 Z h a o D S,G o m e z F A.E l e c t r o p h o r e s i s,1 9 9 8,1 9;4 2-4 2 62 8 He e g a a r d N H,Mo r t e n s e n H D,R o e p s t o r f f P.JC h r o m a t o g r A,1 9 9 5,7 1 7(1-2):8 3-9 02 9 H e e g a a r d N H,B r i m n e s J.E l e c t r o p h o r e s i s,1 9 9 6,1 7:1 9 1 6-1 9 2 03 0 V i c t o r i a A V N;R o n a l d E H e t a l.E l e c t r o p h o r e s i s;1 9 9 8,1 9;4 3 7-4 4 13 1 h e e g a a r d N H,R o b e y F A.J I m m u n o l Me t h o d s,1 9 9 3,1 6 6(1):1 0 3-1 1 03 2 B a r k e r G E,R u s s o P,H a r t w ic k R A.A n a l C h e m,1 9 9 2,6 4(2 3):3 0 2 4-3 0 2 83 3 B j o r n s d o t t i r I,Ke p p D R.E l e c t r o p h o r e s i s,1 9 9 8,1 9:4 5 5-4 6 03 4 L i u J,Vo l k K J,L e e M S e t a l;An a l Ch e m,1 9 9 4,6 6(1 4):2 4 1 2-2 4 1 63 5 C h u Y H,D u n a y e v s k i y Y M,K i r b y D P e t a l.J A mC h e m S o c,1 9 9 6,1 1 8(3 3):7 8 2 7-7 8 3 5T h e o r y a n d A p p l i c a t i o n o f A f f i n i t y C a p i l l a r y E l e c t r o p h o r e s i sWa n g J i n g l a n a n d Q i a n X ia o h o n g(Na t i o n a l C e n t e r o f B i o m e d i c a l A n a l y s i s,B e i j i n g,1 0 0 8 5 0)Ab s t r a c t Af f i ni t y c a pi l l a r y e l e c t r opho r e s i s(ACF)i s a t e c hni que f or s t udy i ng r e c e pt o r-l i g a nd i nt e r a c t i onsA C E e x p e r i m e n t s a r e b a s e d o n t h e d i f f e r e n t v a l u e s o f e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y o f f r e e a n d b o u n d r e c e p t o r.A C E c a n b e i n t r o d u c e d t o m a n y c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s m o d e l s,s u c h a s C Z E,ME C C,C I E F,C G E e t c.I t s a p p l i c a t i o n s i n c l u d e i m mu n o a s s a y s,d e t e r mi n i n g t h e b i n d i n g c o n s t a n t s o f f o r m e d c o m p l e x e s,s c r e e n i n gl ib r a r ie s f o r le a d c o m p o u n d s,s e q u e n c e-s p e c if i c a n d b a s e c o m p o s i t i o n-s p e c if ic r e c o g n it io n o f o l ig o d e o x y-n u c l e o t i d e e t c.K e y w o r d s c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s,a f f i n i t y c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s,p r o t e i n,n u c l e i c a c i d