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实验五 微生物培养基的配制和灭菌 培养基是将微 生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。培养基为微生物的生长提供营养物质和生存空间。它具有微生物正常生活所需的各种养料和适宜的环境条件；（1）适当组分和比例的营养物质；（2）适宜的pH值；（3）合适的渗透压；（4）保持无菌状态。所以培养基是培养微生物所必需的最主要材料。培养基的配制是微生物学工作者的主要技术操作之一。培养基的种类：根据培养基的组成成分，可将培养基分为三类：合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。半合成培养基：由一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成的。从培养基的物理状态来分：液体培养基：不加凝固剂的液态状培养基。固体培养基：在液体培养基中加入2左右的凝固剂的固体状培养基或固体状农副产品培养基。半固体培养基：在液体培养基中加入0.2-0.5凝固剂而成的半固体状培养基。微生物最常用的凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。它不是一种营养物质，只能被极少数种类的细菌分解利用。琼脂是从海藻中（主要是石花菜）提取而制成的。是一种多糖类化合物，主要成分是复杂的多糖硫酸酯钙盐，琼脂是一种可逆性胶体，在常规浓度下加热到96C以上即成溶胶状态，融化的琼脂，当温度下降到42以下，又凝固为固体。一、目的要求 l. 了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。2. 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。3. 熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。二、实验材料 1. 药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO47H2O、FeSO47H2O等。2. 高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌灯。3. 其它：天平、牛角匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养血、吸管、各种包装纸防水纸、绳索、棉花、标签等。三、实验程序 （一）、培养基配制l. 培养基配制的一般方法和步骤（1）称量：按照培养基配方，正确称取各种原料放于搪瓷杯中。（2）溶化：在搪瓷杯中加入所需水量（根据实验需要加入蒸馏水或自来水），用玻棒搅匀，加热溶解。（3）调pH值（调pH也可以在加琼脂后再调），用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。表 6-1 琼脂和明胶的特性比较（4）加琼脂溶化，在琼脂溶化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦，待完全溶化后，补足所失水分，一般数量少，时间短不必补水。（5）分装：在漏斗架上分装。根据不同的需要进行分装，一般制斜面的装置为管高的15 特别注意不要使培养基粘污在管（瓶）口上以免浸湿棉塞，引起污染。（6）包扎成捆、挂上标签。培养基分装好后，塞上棉塞，用防水纸包扎成捆挂上所配培养基名称的标签。（7）灭菌备用。灭菌后如需制成斜面的，应在下磅后取出，摆成斜面（见图6-1）。培养基经灭菌后，必须放在37恒温培养箱中培养 24h，如确无菌生长、方可使用。图6-1 灭菌的试管培养基趁热摆成斜面2三种培养基的配方及具体配制方法（1）. 牛肉膏蛋白陈琼脂培养基（用于分离和培养细菌，是一种天然培养基）。配方：牛肉膏 3g蛋白胨 5g氯化钠3g琼脂20g自来水1 000mLpH7.2 7.4灭菌l.05kgcm2，2530min本实验将原配方配成各种浓缩液。各种浓度如下：30牛肉膏、50蛋白胨、30氯化钠。以配制200mL培养基为例。吸取30牛肉膏2mL；50蛋白胨2mL；30氯化钠2mL；加入有刻度的搪瓷烧杯中，然后用自来水补足到200mL。用玻棒搅匀，在电炉上稍加热，调 pH至 7.4，加琼脂4g，加热熔化，用玻棒不断搅拌，至琼脂完全溶解为止，趁热在漏斗架上装试管，（见图62）。装带有棉塞的无菌试管，装置15的试管高度共12支，作斜面培养基、用铝壳试管帽的里装10mL。约试管高度的 12以上，用作分离时倒平板用。图 6-2 分装培养基图 6-3 将培养基试管包扎成捆分装完毕，以12支为一捆，用防水纸包扎成捆（图6-3），挂上标签，灭菌备用。（2）. 马铃薯（或豆芽汁）蔗糖（或葡萄糖）琼脂培养基（用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基）。配方：去皮马铃薯（或鲜豆芽）200g蔗糖（或葡萄糖）20g自来水1000mL琼脂20gpH天然灭菌（含蔗糖）1.05kg/cm220min（含葡萄糖）0.1kg/cm2 30min制备方法配制200mL培养基为例取上皮马铃薯40g，切成小块、放入无刻度的搪瓷杯中，加水200mL，置电炉上加热煮沸10min，用4层纱布过滤至具刻度的搪瓷杯中，滤液加水补足至200mL。然后加蔗糖4g，加琼脂4g，加热熔化并用玻棒不断搅拌直至琼脂完全溶化分装试管，下面一系例步骤同配细菌培养基相同。（3）. 淀粉琼脂培养基（高氏一号GauseI），用干分离和培养放线菌，是一种合成培养基。配方：可溶性淀粉 20.0gKNO31.0g K2HPO4 0.5gMgSO47H2O 0.5gNaCl 0.5gFeSO47H2O 0.01g琼脂20g自来水1 000mL灭菌1.05kg/cm230min制备方法配制（以配制200mL）培养基为例：吸取配方液：1KNO320mL；1K2 HPO410mL；1MgSO47H2 O10mL；lNaCl10mL；1FeSO4 7H2O0.02mL加水补足至 200mL，置电炉上加热.用另一只搪瓷杯称取可溶性淀粉4g，从200mL中取出少量加入淀粉中，用玻棒调成糊状，待液体沸腾后将淀粉糊洗入培养液中，搅匀，调pH至 7.4，加琼脂 4g，加热至琼脂完全溶化为止，趁热分装试管，以下一系例步骤同于配制细菌培养基的操作方法。3. 无菌水的制备无菌水，为下一次微生物分离实验中所需用而准备。100mL三角瓶（装有玻璃珠），装自来水45mL，试管中装9mL自来水，塞上棉塞，包扎灭菌备用。三角瓶和试管须预先塞好棉塞，并经干热灭菌。（二）分离培养微生物常用器皿的准备1. 清洗一些玻璃仪器：如三角瓶试管，培养皿、吸管等。2. 棉塞的制作：装培养基和分离培养需用的部分玻璃器皿，需加棉花塞梯塞的作用为过滤空气，使试管内外空气可以流通，但外界空气中杂菌不能进入，避免污染、试管、三角瓶都要做棉塞。吸管上部也要塞入棉花，在管口约1-2mm处，用解剖针塞入少许棉花，（约1-1.5cm 长）以防止细菌吸入口中，井避免将口中细菌吹入管内。棉花要塞得松紧适宜。吹时以能通气但不使棉花塞下滑为准。教师示范做试管棉塞，同学每人做5支试管棉塞。棉塞要求不紧不松，两头光滑。试管棉塞的长度约3cm左右。塞入试管内部分约占2/3，头部稍大约占1/3左右，见图6-4。图6-4 试管棉塞的规范要求1. 正确式样2. 管内部分太短，管外部分太松3. 外部过小4. 整个棉塞太松5. 管内部分过紧，外部太松3. 包装培养皿和吸管等。为了使培养皿、吸管、三角玻棒等洗净，干热灭菌后，不让表面暴露，以保证无菌状态，为此干热灭菌前先用旧报纸包装妥当（见示范），每组同学包培养皿6只（一包）。吸管的包装，将塞好棉花的吸管尖端，放在45cm宽的长纸条的一端，约成45角左右，折叠纸条，包住吸管尖部，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌，见图6-5。图65吸管灭菌前用纸包卷示意图（三）培养基和玻璃器材的灭菌方法灭菌的方法，通常可以分为四大类：（1）加热灭菌：包括直接灼烧灭菌、干热灭菌、加压蒸汽灭菌、间歇灭菌和煮沸消毒；（2）过滤去菌；（3）射线灭菌和消毒；（4）化学药剂灭菌和消毒。在本实验中，介绍与培养基和玻璃器材灭菌有关的部份灭菌方法。l. 干热灭菌法（即热空气灭菌法）干热灭菌一般是利用电热烘箱作为干热灭菌器。前面所包装好的玻璃器皿，如带棉塞的三角瓶，试管、包装好的吸管、培养皿等，放入电热烘箱中。打开烘箱顶部的通气孔，接上电源加热，使箱内空气的温度达到160170，关闭通气孔使箱内的温度保持在160左右并维持1.5-2h。时间一到，切断电源。待温度下降6070以下，方可打开箱门取灭菌物品，否则骤冷后易使箱内玻璃仪器破损。2. 加压蒸气灭菌法利用高压灭菌器，使水的沸点在密闭的灭菌器内随压力升高而增高（见表6-2），来提高蒸汽的温度和灭菌的效率。在同一温度下湿热的杀菌效率比干热大，因为微生物细胞蛋白质在湿热情况下，易干凝固（见表6-3）。同时湿热的穿透力强，当水蒸汽与被灭菌的物品相接触后，便放出汽化潜热，逐步提高被灭菌物品的温度，直至与水蒸汽的温度相等，达到平衡为止，从而提高灭菌效率。表62 灭菌器内空气比例与温度之间的关系表63 蛋白质含水量与凝固温度之间的关系手提式高压灭菌锅灭菌的操作步骤如下：（1）在灭菌器内加入一定量的水（有的灭菌器内加水至止水线）。将用防水纸包扎好的灭菌物品如培养基、无菌水等，放进灭菌器内。（2）接通电源，进行加热。（3）当压力到达5bl/in2时，打开放气阀，使锅内的空气和水蒸汽一同排出，直至压力表的压力恢复到零，然后关闭排气阀，继续加热。（4）当压力表的压力到达15bl/in2（即 1.05kg/cm2）时，此时灭菌器内的温度达到121，维持30min不变。对热不稳定的培养基灭菌时，应适当降低压力，延长时间。（5）灭菌时间一到，切断电源，待压力下降至零时，才能打开排气孔，然后打开灭菌器盖，取出物品。如果灭菌后的固体培养基要做成斜面，需趁热放置。还需检查培养基灭菌是否彻底。3. 间歇灭菌法常采用阿诺（Arnold）氏灭菌器和柯赫（Koch）氏灭菌器或蒸笼灭菌，常压条件下蒸汽温度不超过100。在没有高压灭菌器设备的情况下或不宜加压灭菌的物品，可采用此法灭菌。方法是：待灭菌物品放在灭菌器或蒸笼里，每d蒸煮1次，每次煮沸lh，连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37C恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死的残留芽孢萌发成营养体，以便下1次蒸煮时杀灭。4. 过滤除菌法一些不能加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），可以用过滤除菌法，一般用细菌过滤器进行除菌。（教师示范）细菌过滤器中的过滤板常用陶瓷、硅藻土或石棉等做成，过滤板孔眼很小，细菌不能通过。因此，过滤后的液体就除去了细菌。在进行过滤除菌前，整个细菌过滤器和接受液体的器皿，必须要包装妥当并进行加压蒸汽灭菌后方可使用。下面介绍石棉板滤器的构造及其操作方法。石棉板滤器又称蔡氏（Scitz）滤器，它是由石棉制成的圆形滤板和一个特制漏斗组成（见图6-6a）。此漏斗分上下两节。上节为圆形金属筒，下节为金属漏斗。两节由三个活动螺旋固定，便于装卸。使用时拆开两节，将滤板放在漏斗上的金属筛板，再加上上节，然后将螺旋扭紧，将欲滤溶液置于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张无菌的新滤板。石棉板滤器因容积大小不同而有各种型号，石棉板也有不同规格型号使用时必须根据需要搭配妥当。图6-6b为一个注射器装备滤器，用于不便高压蒸汽灭菌的维生素液或其他溶液的除菌和气体的除菌，极为方便。图66 过滤除菌装置a. 蔡氏过滤器b. 注射器滤器装置5. 紫外线灭菌波长260280nm之间的紫外线有很强的杀菌能力，一般紫外灯管能产生253.7nm的紫外光，杀死力强而稳定，但穿透力弱一般只适宜物体表面、空气灭菌。例如接种室、培养室、手术室、药厂包装室等空气灭菌。一般30w灯管、9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0.5h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时，先喷洒石碳酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。在进行微生物接种和分离等操作时，常须用紫外线来杀灭接种室（箱）空气、台面等处的微生物。（参观示范）紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力较弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。紫外线对眼粘膜及视神经有强烈的损伤作用，对皮肤有刺激作用，所以不能直接在紫外线灯开启下工作和用眼睛直视开启的紫外灯。6. 化学药剂消毒灭菌微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂，详见表6-4。表64 各类化学药剂消毒灭菌的浓度、作用方式和用法思考题 1、配固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？2、培养基中加琼脂的作用是什么？3、干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌的场合有何不同？4、如何检查培养基灭菌是否彻底？