应用基因芯片检测禽常见病毒的研究.docx

应用基因芯片检测禽常见病毒的研究*
吴时友 尹燕博 郑彤彤 韩丽敏 田振宇 张巧燕 毛雪松
山东澳兰生物工程研究院 青岛市 山东省 266101

摘要：利用RT-PCR或PCR技术扩增出新城疫病毒（Newcastle disease virus）、禽流感病毒（Avian Influenza）、传染性支气管炎（Infectious bronchitis virus）、、鸡马立克氏病(Marek’s Disease )、传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis）和鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal Disease )的各一段保守序列，通过微量点样技术这些探针点在硝酸纤维素膜上，从而产生二维DNA探针阵列，即基因芯片（gene chip）。由病料中提取核酸，通过RT-PCR或PCR和标记技术，将获得的PCR产物和基因芯片进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品的快速，并行和高效的检测及分析。

近年来，在养禽业的迅猛发展的同时，禽的病毒性疾病变得更加复杂，混合感染,交叉感染已成为目前疾病的显著特征。集约化养殖的发展要求快速，及时，准确的对疾病作出诊断，但目前的一些方法，如病毒分离、血凝（HA）、血凝抑制（HI）、琼脂扩散、ELISA等费时费力，且一次只可检测一种病原，不能够满足其要求。我们所研制的病毒病基因芯片(gene chip)具有以上方法不可比拟的优越性。
基因芯片(gene chip)是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高薪技术，它主要是通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对DNA序列的准确、快速、大量信息的检测。芯片上集成的成千上万的密集排列的分子微阵列能在短时间内分析大量的生物分子，使人们快速准确地获得样品中的生物信息，其效率是传统的检测手段的成百上千倍，它是继大规模集成电路之后又一具有深远意义的科学技术革命。基因芯片技术应用于病毒性疾病可灵敏，特异，快速的检测病原，并且一次可检测多种病原,将有助于及时，快速，准确的发现病毒性疾病，避免病毒性病毒对养殖业造成的巨大损失，为养殖业的集约化发展创造有利的条件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂
Taq DNA聚合酶购自上海生工，PCR产物纯化试剂盒购自v－gene生物科技有限公司， M-MLV、dNTP购自Promega公司，RNAsin 购自大连宝生物工程有限公司,鲑鱼精 DNA，购自Sigama 公司，裂解液，由本研究院配制。
1.1.2毒株
NDV、AIV、IBV、MD、ILT、IBDV均购自中监所。
1.1.3仪器和设备
仪器和设备：PCR仪；点样器；杂交仪；扫描仪均为自行设计，委托生产厂家制造。

.2. 引物设计

作者:吴时友(1941-),男,研究员,主要从事生物技术在动物疫病诊断中的应用研究。
*专利号：02155408.0
通过gene bank 分别查找到NDV、AIV、IBV、MD、ILT、IBDV各数条序列，然后使用DNAStar分析每一种病毒的高度保守序列，设计出针对这些病毒的引物。引物见表1。

1.3 基因芯片的制作

1.3.1种毒核酸的提取

各取细胞培养液400ul于1500ul离心管中,加裂解液600ul,稍振荡，加入氯仿450ul,振荡均匀后-20℃静置10min。12000r/min离心10min,取上清于新的离心管中，加异丙醇800ul, -20℃静置1h。12000r/minl离心10min,去上清，沉淀用冷乙醇洗涤，置超净工作台吹干。若病毒基因组是DNA可直接进行PCR，若是RNA则要进行RT。
1.3.2 核酸探针的扩增
以1.3.1所获得的核酸为模板，使用1.2所设计的引物，分别扩增出NDV、AIV、IBV、MD、ILT、IBDV的目的片断，以作为探针。PCR的反应条件如下
反应体系：
水 17ul
5 ×buffer 4 ul
Mgcl(25m M) 4 ul
dNTP（各2.5mM） 2.5 ul
Taq (4U) 0.5 ul
P1+P2 (50Pmol/ul) 0.5+0.5 ul
模板 2 ul
注： 稍离心（4000r/min）
循环参数
94.5℃ (预变性) 2min
94.5℃ (变性) 30s
55℃ (退火) 40s
72℃ (延伸) 90s
72℃ (终延伸) 9min
1.3.3点膜

通过微量点样器将所获得的探针点在预处理的硝酸纤维素膜上。具体矩阵分布见图1.。

图1：基因芯片上探针的分布情况

阳性
NDV
AIV
IBV
阳性
NDV
AIV
IBV
阴性
ILT
IBDV
MDV
阴性
ILT
IBDV
MDV

1.4样品的处理
1.4.1 核酸的提取 方法同1.3.1

1.4.2 核酸的扩增

方法，引物，循环参数同1.3.2，只是反映体系不同。其反应体系如下。

反应体系：
H2o 10ul
Buffer 3ul
Mgcl2(25mM) 4ul
dNTP(2.5mM) 2.5ul
Biotin-11-dUTP 4ul
Taq(5U/ul) 1ul
Pa+Pb(50pmol/ul) 4ul
模板 2ul

1.5 杂交

加500ul预杂交液于基因芯片上，42℃处理40min 。取20ul 1.4.2的产物于1.5ml的离心管内,100℃变性10min.-20℃冷却5min,加杂交液450ul,混匀,于基因芯片上,42℃杂交1h。分别用2×SSC,0.1×SDS和0.1×SSC,0.1×SDS各洗三次，加400ul3%BSA,42℃封闭30min，450ul缓冲液中加1.6ulAV-AP,42℃酶联20min，先用洗涤液洗膜三次,后加入显色液(450ul底物液+1.6ulBCIP+1.6ulNBT),常温或42℃显色3~5min。用蒸馏水或自来水冲洗,终止显色。
1.6 杂交结果的分析
将杂交完毕晾干的DNA阵列用自制的芯片扫描仪进行扫描分析，根据大量样品的分析，设置读数0.1以下为阴性，0.2以上为阳性，两者之间为可疑。打印诊断报告。
样品同时进行病原分离、HI和PCR或RT-PCR和其他检测方法进行比较。
阳性和阴性对照:分为猪和鸡的血红蛋白中珠蛋白基因片段,加入反应系统,以监视标记和杂交、显色系统是否有效。
表1：芯片探针的引物设计

病毒 核 苷 酸 序 列 产物长度
NDV P5 5’-CTT GAC ACC TCA TAC TGT AT-3’ 622
P3 5’-CCC AAG CCA TAA TAA GGT CTT-3’
AIV P5 5’-CTG GTG CAC TTG CCA GTT G-3’ 464
P3 5’-GAT CAA GAA TCC ACA ATA TC-3’
IBV P5 5’-CAT AAC TAA CAT AAG GGC AA-3’ 602
P3 5’-TGG TCC TCT TCA AGG TG-3’
MD P5 5’-GTT CTA CCG GAC TGG CGC TCG-3’ 460
P3 5–ACA TTC TTT TCG TTG GCG TGG TAT-3
ILT P5 5’-ACG ATG ACT CCG ACT TTC-3’ 643
P3 5’-CGT TGG AGG TAG GTG GTA-3’
IBDV P5 5’-GTC ATT GAA GGC GTG CGA GAA-3’ 512
P3 5’-CAA GAT GGT ATT GGC GTC CTG-3
注：P5 表示上游引物，P3表示下游引物。

2 结果
2.1准确率检测的结果

我们针对性的对NDV AIV IBV MD ILT IBDV毒株分别进行了检测，杂交结果：六张芯片分别出现NDV AIV IBV MD ILT IBDV特异性杂交点,检测结果皆为阳性，没有非特异性杂交点的出现。同时阳性对照明显,读数大于0.3，阴性对照则小于0.1.

2.2重复性检测结果

同时各取10管阳性毒株进行重复性检测。结果如表2。

表2 基因芯片重复性检测结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 阳性率
ND + + + + + + + + + + 100％
AI + + + + + + + + + + 100％
IB + + - + + + + + + + 90％
MD + + + + + + + + + + 100％
ILT + + + + + + + + + + 100%
IBD + + + - + + + + + 90%
注：数字1～10为Eppndorf管的编号，“＋”表示阳性，“－”表示阴性。

2.3检出率的检测结果

对7个鸡场66个发病死亡病料分别用病毒分离、HI、PCR或RT-PCR和芯片方法进行对比检测，结果如表3

表3 病毒分离、HI、PCR或RT-PCR和基因芯片的检出率
NDV AIV IBV MD ILT IBDV
病毒分离和HI 7（11%） 3(4.5％) 3（4.5%） 0（0％） 0（0％） 0（0％）
PCR或RT-PCR 48（73%） 9（14%） 23（35%） 19（28.7%） 3（4.5％）9（14%）
基因芯片 54（81%） 15（22%） 23（34.8％） 33（50%） 9（13.9%） 15（22%）
注：数字为检出病毒鸡的只数，括号内的数字为其百分比

3讨论
基因芯片的制备是利用核酸分子间碱基配对作用，然后通过酶催化预结合在核酸上的底物，从而显现出核酸结合信号的基本原理。基因芯片的制作较为复杂，为保证芯片的质量应注意以下事项：（1）样品核酸的提取提取的核酸必须有较高的纯度和一定的量，以保证标记的质量和特异性扩增，如果纯度不够，可能导致后面的杂交出现非特异点。（2）样品核酸的标记：掺入的生物素必须达到一定的浓度，以保证杂交点的灵敏度，若浓度不够，杂交结果常会出现假阴性 。（3）同源核酸杂交：应掌握杂交温度控制在52℃左右,温度过低，会出现非特异杂交点，使特异性降低，温度过高，则往往出现假阴性。
鸡病毒病基因芯片和常规检测疾病的方法相比较具有以下优点：（1）准确：基因芯片设有阳性和阴性对照，可避免环境和人为因素造成的错误的诊断。（2）快速：病毒分离需要两周的时间，而芯片只需8个小时左右。(3)灵敏：芯片的灵敏性可比PCR技术高1000倍。（4）信息量大：病毒分离和PCR一次只检一种疾病，而芯片一次可检测10～20种疾病。
基因芯片起源于20世纪80年代，近年来得到了迅猛的发展，但主要是应用于医药和研究领域，应用于养殖业的疾病检测在我国尚属首次，这将会极大促进养殖业的发展。

参 考 文 献

1.Pease,A、C., et al:1994 Light-generated oligonucleotide for rapid DNA seqaeuce analysis. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91 :5022-5026.
2.马立人、蒋中华等：2002年 生物芯片 化学工业出版社
3.Jipin, Li.,et al: 2001 Typing and subtyping Influeza Virus Using DNA Microarrays and Miultiplex Reverse Traascriptase PCR. J.Clin.Microbiol.39: 2, 696-704.
4.Vladimir, M., 2001 Identificationg of Rifampin-Resistant Mycobacetrium tuberculosis Strains by Hybridization, RCR and Ligase Detection Reaction on oligoncceleotide Microchips J.Clin.Microbiol., 39:7,2540
5.John, w.w.,et al: 2000 Comparative Evaluation of Three Haman Immunodeficiency Virus Genotyping Systems: the HIV-Genotyp R Method, the HIV PRT Genechip Assay, and the HIV-1 RT Line Probe Assay. J.Clin.Mirobiol. 38:8,3022-3028.
6．邢婉丽 程京：2004年 生物芯片技术 清华大学出版社