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实验六 苯硫脲尝味的群体遗传学调查
一、实验目的
1. 测定人群中PTC 尝味基因的表现型和基因型， 理解孟德尔遗传基因型与表现型的对应关系。
2．了解酶切扩增多态序列（又称为PCR-RFLP）技术的原理，学会用PCR-RFLP 技术检测单核 苷酸多态性 （SNPs）。在分子水平上测定PTC 尝味的基因型。
二、实验原理
苯硫脲（phenylthiocarbamide，PTC）是硫脲的苯基衍生物，为白色结晶粉末， 因含有硫代酰胺基（N-C=S）官能团而有苦涩味。能尝出1/750,000-1/50,000 PTC浓度溶液味道的人（苦涩味，少数人感到甜味） 称为苯硫脲“尝味者”, 只能尝出PTC 浓度大于 1/24,000 溶液的味道的人称为苯硫脲“味盲者（nontaster）”。
PTC 尝味能力是受单基因控制的孟德尔遗传性状，是由位于7 号染色体上的一种苦味味觉感受器基因 TAS2R38 决定的，属于常染色体不完全显性遗传。尝味者中显性基因T的纯合子(TT)能尝出1／750,000-1／6,000,000 的PTC 溶液的苦味，杂合子(Tt) 只能尝出1 ／480,000-l／380,000 的PTC溶液的苦味。
人类的 PTC 尝味基因又名 PTC、T2R38 或 T2R61。绝大多数尝味者与味盲者的 区别在于三处单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs)：一处是145 位，味盲者为 G145（编码丙氨酸ala），尝味者为C145（编码脯氨酸pro）；第二处是785 位，味盲者为T785（编码缬氨酸val），尝味者为C785（编码丙氨酸ala）；第三处 在886 位，味盲者为A886（编码异亮氨酸ile），尝味 者为G886（编码缬氨酸val）。因此味盲者PTC 多肽中三处对应的氨基酸分别是ala49、val262 和ile262， 被称为AVI等位基因，而尝味者的三处是pro49、 ala262 和val262，被称为PAV等位基因。如图1所示。

图1 PTC 尝味基因上的三个SNP位点
味盲者的PTC 编码区有五个限制性内切酶 Fnu4H1 的识别位点（识别序列5’-GC↓NGC3’），如果是尝味者，则其第785 位SNP 恰好形成了一个额外的Fnu4H1 识别位点（GCTGC）。 因此可以利用这个SNP 造成的限制性位点多态性，设计引物扩增包含785 位SNP位点的PTC Fnu4H1 基因编码区的一部分，然后用Fnu4H1切割扩增产物，根据是否能把扩增产物切开而判定是某个人的单倍型（haplotype）。如图2所示。

图 2 味盲者PTC 尝味基因编码区序列

三、实验用品
1．人口腔上皮细胞总DNA、引物Ⅰ和Ⅱ（20μΜ）、TaqDNA聚合酶（5U/μl）、10×PCR反应缓冲液、dNTP（2.5mM）、灭菌蒸馏水、限制性内切酶Fnu4H1（20U/μl）、10×酶切缓冲液。
2．2%的琼脂糖凝胶、1×TAE、6×上样缓冲液、DNA Marker、Goldview染料。
3．PCR仪、凝胶成像系统、微量加样器（5μl、20μl、200μl）、枪头（20μl、200μl）及离心管(1ml、0.5ml)、容器盒、恒温水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装置、烧杯、保鲜膜、封口膜、微波炉、250ml三角烧瓶、透明胶带、托盘天平、台式高速离心机。
四、实验步骤
1. 口腔上皮细胞总DNA的提取
（1）每实验小组选取1 名受试者，用灭菌牙签刮取口腔上皮细胞。
（2）在1.5 ml 灭菌微量离心管中加入100 µL 灭菌水。
（3）受试者用无菌牙签轻刮口腔腮内侧，刮下来的细胞在灭菌水中漂洗。
（4）涡旋振荡器涡旋振荡混匀10 s。
（5）离心机瞬时离心10 s。
（6）沸水浴中煮沸5 min。
（7）离心机13200rpm 离心2 min。
（8）基因组DNA 4°C 保存备用。
2. PCR 扩增PTC基因片段，反应体系如下：

上游引物：hPTC Forward 5’-aactggcagaataaagatctcaatttat-3’ 下游引物：hPTC Reverse 5’-aacacaaaccatcacccctatttt-3’。按以上次序，将各物质加入到一只无菌的0.2ml离心管中。轻轻混匀后，离心5秒钟，加入一滴液体石蜡盖于反应混合液的表面，然后放入PCR仪中进行循环反应。PCR反应程序如下：
94℃ 5min(预变性)---94℃ 30s(变性)---55℃ 30s(退火)---72℃ 30s(延伸)---
step 1 step 2 step 3 step 4
72℃ 10min(延伸)---4℃ 保存
step 5 step 6
其中从step2到step4循环40次，PCR产物总长303bp，反应结束后置4℃冰箱保存。
3. PCR产物的Fnu4H1酶切
反应体系15μl其成分如下：
PCR产物 6μl
Fnu4H1（10U/μl） 1μl
10X酶切缓冲液 2μl
无菌水 6μl
置37℃水浴消化1小时，4℃保存
4.琼脂糖凝胶电泳检测
（1）胶板的准备
取有机玻璃内槽，洗净晾干。取透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（注意，将透明胶带紧贴于有机玻璃内槽的两端边上，不要留空隙）。将有机玻璃内槽置于一水平位置，在距离底板0.5~1.0ml的位置放入梳子。
（2）2%的琼脂糖凝胶的制备
称取1克琼脂糖，置于锥形瓶内，加入50ml 1×TAE，瓶口用保鲜膜封盖，在微波炉中加热直至琼脂糖全部溶解，得到2%琼脂糖凝胶液，待其冷却至65℃左右，加入2.5μl溴化乙啶贮存液（10mg/ml），使溴化乙啶终浓度为0.5μg/ml。小心混匀并倒在有机玻璃内槽中，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开，避免产生气泡，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1小时左右，待胶凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。
（3）将凝胶放入电泳槽中，加入恰好没过胶面1mm深的足够电泳缓冲液，预电泳10min。
（4）每份限制酶切产物取10μl，加2μl  6×上样缓冲液，混匀后加入到样品孔中，以100V 电泳50分钟。
（5）断电后取出凝胶，放在紫外透射仪中观察并记录PCR-RFLP结果。
电泳结果中基因型为TT的尝味者能够出现2条酶切条带，基因型为Tt的尝味者能够出现3条酶切条带，基因型为tt的味盲者能够出现1条酶切条带，如图3,4所示。

图3 不同基因型酶切条带数目

图4 PCR产物酶切电泳结果
五、实验结果与分析
观察并记录琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段长度，绘制出不同基因Fnu4H1 RFLP等位片段与系谱相关图。