离心技术及物质代谢实验.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,离心技术及物质代谢实验,离心技术及物质代谢实验,第1页,试验内容,离心技术,邻甲苯胺法测血糖含量,糖酵解中间产物磷酸丙糖判定,酶法,测定血浆胆固醇,（下午）,离心技术及物质代谢实验,第2页,定义,：离心技术,（,Centrifuge technology,）,是利用物体高速旋转时产生强大离心力，使置于旋转体中悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使一些颗粒到达浓缩或与其它颗粒分离之目标。,用途,：离心是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离最常见方法之一。,离心技术,离心技术及物质代谢实验,第3页,第一节 离心技术原理,当一个粒子在高速旋,转下会受到离心力,F,作用，,其大小为：,。,m,：沉降粒子有效质量,r,：粒子旋转半径，单位,cm,：粒子旋转角速度,离心技术及物质代谢实验,第4页,离心机转速表示方法,：,1.,每分钟转数,R,evolutions,P,er,M,inute(rpm),2.,相对离心力,R,elative,C,entrifugal,F,orce(RCF),离心技术及物质代谢实验,第5页,RCF,表示实际离心力相当于地球引力倍数，常见数字乘,“,g,”,来表示。,980,2,r,w,RCF,=,=,F,mg,RCF=1.11910,-5,(rpm)r,rpm,：每分钟转数，单位,r/min,g,：重力加速度，约等于,980cm/s,：单位弧度,/,秒（,rad/s,）,相对离心力：,离心技术及物质代谢实验,第6页,沉降颗粒在离心管中所处位置也不一样，则所受离心力不一样。所以在描述超速离心条件时，通常见,RCF,代替,rpm,，因为它能够真实地反应颗粒在离心管内不一样位置离心力及其动态改变。,F=m*,*r,离心技术及物质代谢实验,第7页,沉降系数,定义：沉降速度与离心力加速度比值，即单位离心场中颗粒沉降速度单位为,“,S,”,。,S=V/,r,大家要求,1S=110,-13,秒,S=V(D-D)/f,用途：对于一些大分子化合物，当它们详细结构和分子量不很清楚时，经常见沉降系数这个概念去描述它们。如核糖体,RNA,有,30S,亚基和,50S,亚基，这里,S,就是沉降系数。,。,离心技术及物质代谢实验,第8页,第二节 离心机主要类型和结构,工业用离心机,离心机,制备型离心机,试验用离心机,分析型离心机,离心技术及物质代谢实验,第9页,制备性离心机,一、制备性离心机类型：,1.,普通离心机,2.,高速冷冻离心机,3.,超速离心机,离心技术及物质代谢实验,第10页,普通离心机,高速冷冻离心机,超速离心机,最大转速（,rpm,）,6000,0,25000,50000,80000,超速离心机装有真空系统，这是它与高速离心机主要区分,.,离心技术及物质代谢实验,第11页,转头：包含角式转头、荡平式转头、区带转头、垂直转头、连续流动转头,离心管：,包含,塑料离心管、,玻璃离心管、,不锈钢离心管,制备性离心机主要构件：,离心技术及物质代谢实验,第12页,角式转头,荡平式转头,离心技术及物质代谢实验,第13页,塑料离心管,玻璃离心管,离心技术及物质代谢实验,第14页,首先依据待离心液体性质及体积选取适当离心管,使用各种离心机前，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，对称放置，不得使用奇数个离心管离心过程中不得随意离开,若要在低于室温温度下离心时，提前预冷,注意最高转速，不得超速使用。,离心操作,注意事项,离心技术及物质代谢实验,第15页,二、胰岛素对血糖含量影响及测定,试验目标：,经过试验方法证实胰岛素对血糖含量降低作用，即检测家兔注射胰岛素前后血糖浓度改变,.,掌握邻甲苯胺法测定血糖浓度。,离心技术及物质代谢实验,第16页,离心技术及物质代谢实验,第17页,试验原理：,1.,胰岛素降血糖机理：,1),促进肌肉、脂肪组织对葡萄糖通透性，促进葡萄糖进入这些细胞；,2),糖原合成,糖原分解；,3),糖有氧氧化；,4),磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶合成糖异生；,5),激素敏感性脂肪酶脂肪动员离心技术及物质代谢实验,第18页,2.,邻甲苯胺法测血糖含量,葡萄糖在浓酸溶液中（加在含有硼酸冰醋溶液,中），水 浴加热至,100,左右，脱水生成羟甲基呋喃,甲醛（或称羟甲基糠醛），后者能与邻甲苯胺缩合生,成蓝绿色化合物，依据颜色深浅并进行,630 nm,波长,比色测定其含量。,离心技术及物质代谢实验,第19页,试验方法,1.,胰岛素对血糖含量影响：家兔注射胰岛素前后,血糖含量改变。,1,）取饥饿,12,小时家兔一只，统计体重。,2,）采取血标本：用二甲苯棉球涂擦家兔耳部，使局部血管,扩张，然后用刀片,纵行切开边缘耳,静脉，让血液自然滴,入试管中，搜集约,2ml,，待血凝固后，分离血清。,3,）按家兔体重，皮下或腹腔注射,1.5,单位,kg,胰岛素，统计,注射时间，待,40,分钟后，用一样方法取血，分离血清。,4,）将注射胰岛素前后血清，分别测定血糖含量。,离心技术及物质代谢实验,第20页,2.,血糖含量测定：,1.,1,）取试管四支，按下表操作,试剂（,ml,）,测定管（前）,测定管（后,),标准管,空白管,血清（前）,血清（后）,糖标准,蒸馏水,邻甲苯胺试剂,0.1,4.0,0.1,4.0,0.1,4.0,0.1,4.0,离心技术及物质代谢实验,第21页,2,）混匀，置沸水浴中加热,10,分钟，取出马上置冷水中冷却,3,）用,630nm,波长，以空白管校正吸光度为,0,，分别测定各管吸光度值,4,）计算：,180,离心技术及物质代谢实验,第22页,当前我国医院多采取,葡萄糖氧化酶法,和,邻甲苯胺法测定血糖,。,葡萄糖氧化酶法,邻甲苯胺法测定血糖,优点,特异性强、价廉、方法简单,不易出现假性过高或过低,结果较可靠,正常值,空腹全血为,3.6,5.3mM/L,空腹全血为,3.3,5.6mM/L,离心技术及物质代谢实验,第23页,注意问题,二甲苯能扩血管不过它有溶血作用，所以切开取血前要晾一会。,沸水浴时注意安全；管口朝墙，预防高温溅出伤到自己。,离心技术及物质代谢实验,第24页,糖酵解中间产物判定,【,试验目标,】,检测糖酵解中间产物磷酸丙糖生成。,【,试验原理,】离心技术及物质代谢实验,第25页,3-,磷酸甘油醛,磷酸二羟丙酮,6-,磷酸果糖,1,6-,二磷酸果糖,ADP,ATP,6-,磷酸葡萄糖,ADP,ATP,葡萄糖,3-,磷酸甘油醛脱氢酶,NAD,+,1,3-,二磷酸甘油酸,3-,磷酸甘油酸,ADP,ATP,NADH+H,+,丙酮酸,酶,-SH+ICH2COOH,酶,S-CH2COOH+HI,一碘醋酸,一碘醋酸,一碘醋酸,一碘醋酸,一碘醋酸,一碘醋酸,一碘醋酸,一碘醋酸,离心技术及物质代谢实验,第26页,红棕色,离心技术及物质代谢实验,第27页,【,试验方法,】,取试管,3,支，编号，按下表进行操作,统计三管所发生情况，并加以简明分析,CCL,3,COOH,作用：强酸，使糖酵解全部酶失活。,一碘醋酸作用：使,3-,磷酸甘油醛脱氢酶失活。,硫酸肼作用：稳定磷酸丙糖，使其不向其它方向转变。,离心技术及物质代谢实验,第28页,试 剂（,ml,）,1,2,3,pH7.4,磷酸盐缓冲液,一碘醋酸,硫酸肼,10,CCL,3,COOH,酵母液,水,2.0,0.5,0.5,1.0,4.0,2.0,0.5,0.5,4.0,1.0,2.0,4.0,2.0,混匀，在,37,38,恒温水浴中保温,30,分钟,一碘醋酸,硫酸肼,10,CCL,3,COOH,水,2.0,1.0,1.0,0.5,0.5,1.0,混匀，静置,10,分钟，,离心,3000,转,/min,10,分钟，再取三支试管，对号按下表操作,上清液,1mol/LNaOH,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,混匀，在室温放置,10,分钟,2,，,4,二硝基苯肼,1mol/L NaOH,0.5,3.5,0.5,3.5,0.5,3.5,离心技术及物质代谢实验,第29页,试验注意事项：,试管、移液管洗洁净；,加入试剂正确；,混匀；,成腙反应前，溶液必须先碱化并在室温放置,10min,，目标是使磷酸丙糖中磷酸基水解脱去，生成颜色比较稳定。,离心技术及物质代谢实验,第30页,血清胆固醇测定（酶法）,【,试验目标,】,1.,了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇原理。,2.,掌握血清胆固醇测定临床意义。,离心技术及物质代谢实验,第31页,血清中总胆固醇包含胆固醇酯,(CE,70%),和游离型胆固醇,(FC,30%),。胆固醇酯酶（,CEH,）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸（,FFA,），胆固醇在,胆固醇氧化酶,（,COD,）作用下氧化生成,4,胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶（,POD,）催化与,4-,氨基安替比林（,4-AAP,）和酚反应，生成红色醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇含量呈正比，在,500 nm,波优点测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇含量。反应式以下：,【,试验原理,】,离心技术及物质代谢实验,第32页,1.,标本：不溶血血清或血浆标本。血浆用肝素钠、,EDTA,抗凝，不可用草酸盐、氟化物。,2.,取试管,3,支，编号，按下表操作。,【,试验方法,】,加入物（,ul,）,测定管,标准管,空白管,血清,10,-,-,胆固醇标准液,-,10,-,蒸馏水,-,-,10,酶应用液,1000,1000,1000,3,.,混匀后，,37,水浴保温,15,分钟，在,500 nm,波优点比,色，以空白管调零，读取各管吸光度。,离心技术及物质代谢实验,第33页,【,计算,】,A,标本,CHO,（,mmol/L,）,=,标准液浓度,A,标准,【,标准液,】,胆固醇,5.17 mmol/L,（,200mg/dL,）,【,正常参考范围,】,3.10,5.70mmol/L,离心技术及物质代谢实验,第34页,