1、细胞总蛋白提取方法
一、溶液配制
1. 100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml
称取NaF 41.99mg，超纯水8ml溶解后定容至10ml。
2. 100 mM PMSF
3. RIPA溶液 100ml
成分
分子量
终浓度
Tris
121.14
0.6 g
5.0 mM (pH 7.4)
NaCl
58.44
0.87 g
150 mM
EDTA
372.24
37.22 mg
1 mM
NP-40
1 ml
1%
SDS
0.1 g
0.1%
脱氧胆酸钠
0.5 g
0.5%
溶解于80
2、ml超纯水中，待溶解后加入HCl调pH值至7.4，定容至100 ml。
※使用前加入
成分
储存浓度
加入量
终浓度
PMSF
100 mM
10μl/1ml
1 mM
NaF
100 mM
10μl/1ml
1 mM
Aprotinin
10μg/μl
0.2μl/1ml
2μg/μl
Leupetin
10μg/μl
0.2μl/1ml
2μg/μl
二、方法
1. 细胞收取
1) 细胞传代至60mm培养皿中，待细胞融合约100%，收集细胞
2) 弃培养基，加入PBS 2ml清洗培养皿一次，弃PBS。
分两次将细胞收至一个管
3、中
3) 加入0.05%胰酶2ml，37℃温育1min。
4) 待细胞变形后，将细胞吹下转移至一个1.5ml
ependorf 管中，10,000rpm×3min，4℃
5) 弃上清，1ml预冷的PBS清洗沉淀，10,000rpm×3min，4℃
6) 重复PBS清洗一次
7) 弃上清，-80℃冻存待裂解
2. 蛋白提取
加入缓冲液前先将细胞沉淀敲散，加入后吹打细胞沉淀使其松散
1) 向细胞沉淀中加入200μl RIPA缓冲液(含1mM PMS、
1mM NaF、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin)，混匀
后冰上放置40mins
2) 10,000rpm×15min，4℃
将上清转移至一个新的ependorf 管中（约250μl）
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