实用血培养厌氧菌分离鉴定及药敏试验方.doc

实用厌氧菌分离鉴定及药敏试验方法临床重要的厌氧菌(主要是内源性)主要是拟杆菌科（G-b）和厌氧球菌。血培养阳性厌氧菌主要有拟杆菌属、梭杆菌属、普雷沃菌属、卟啉单胞菌属、消化链球菌属及其他厌氧菌。一、必需的设备 厌氧罐、厌氧盒、厌氧袋（标本少） 厌氧发生气袋 厌氧指示剂二、培养基的准备 非选择厌氧血平板 布氏血平板 脑心浸液琼脂 CDC厌氧血琼脂 哥伦比亚血琼脂 新鲜配制或经24h预还原（厌氧环境放置）！特殊成份（降低氧还电势）: L-半胱氨酸、氯化血红素(Hemin)、VitK1 选择性厌氧血平板：自制、商商品化三、 厌氧血培养瓶报警后 步骤一：转种转种（四区划线）需氧厌氧血平板、巧克力平板，5CO2还原后的厌氧血平板24h检查生长，G染色，分离，鉴定48h 检查 原始平板是否有新菌落出现打开步骤二：耐氧试验确认厌氧菌培养48h后可能有以下几种情况需氧厌氧血平板巧克力平板处理方法厌氧血平板处理方法情况一+常规+耐氧试验、G染色再培养48h情况二+可能流感杆菌+情况三+G染色，厌氧菌情况一和二：耐氧试验24-48h再观察结果，有确认厌氧菌的菌落按下边鉴定步骤。耐氧试验方法：选择每种形态的单菌落，转种一个厌氧血平皿和巧克力平皿，分别培养。情况三：相当于耐氧试验，再结合菌落菌体形态，可以确认厌氧菌，用以下方法鉴定。四、厌氧菌鉴定方法（一）快速商品鉴定系统（4h报告结果）1 无须厌氧培养，4h培养后人工输入结果，电脑软件辅助报告结果：VITEK ANI卡Rap ID 32AMicroScan Anareobe PanelRap ID ANA II等2 厌氧环境培养24-48h观察结果API 20A特点是快速，可鉴定到种水平，但有时不一定获得满意结果，可同时进行以下操作提供临床初步报告。（二）初步鉴定方法1 临床重要的厌氧菌特殊菌落形态和菌体形态及特征（图示） G-cb有色素普雷沃菌、卟啉单胞菌 细G-b，两端变尖具核梭菌 多晶（空泡），染色着色浅G-b拟杆菌属 非常小的G-c韦容球菌属 “咬”琼脂（凹陷） 解尿拟杆菌群2 产色素、荧光 产黑色素拟杆菌卟啉单胞菌、普雷沃菌 砖红色荧光中间普雷沃菌、洛氏普雷沃菌 黄绿色荧光梭杆菌属3 特殊鉴定用抗生素纸片（Oxoid, BBL,Diffico等） 万古霉素5g/ml卡那霉素1,00g/ml多粘菌素10g/ml 聚茴香脑磺酸钠(SPS)1,00g/ml：抑菌环直径小于10mm（R），大于12mm（S） 于厌氧血平皿贴1/4平皿（划线第一区）；如果需要硝酸盐或SPS纸片，则贴另1/4区菌群 万古 卡那 多粘菌素 SPSG- R V V G+ S V VB.frag 群 R R R解尿拟杆菌群 R S S梭杆菌属 R S S卟啉单胞菌属 S R R普雷沃菌属 R R V韦荣氏球菌属 R S S厌氧消化链球菌 S Rs R S其他G+c S S R R4 生化反应 触酶、吲哚、硝酸盐五、厌氧菌药敏1 经验用药J 99%厌氧菌对甲硝唑、克林霉素、氯霉素、亚胺培南敏感J 9599%- 内酰胺酶/- 内酰胺酶抑制剂 复合抗生素类、K 革兰阴性厌氧杆菌对头孢菌素类抗生素敏感性不同，头孢菌素类、- 内酰胺酶、青霉素类等。2 常规做厌氧菌药敏试验指征 脑脓肿、心内膜炎、骨髓炎、关节感染、血管移植、辅助装置、菌血症从正常无菌部位来源的标本，除非确认是污染的。J 医生是否要求做药敏试验是非常重要的L 当几种菌混合感染确定哪个菌做药敏，做什么抗生素很难判断，一般来讲，具有高致病性的菌或不能预测药敏结果的常用抗生素，或两者具备，考虑做药敏试验，包括拟杆菌属某些种，普雷沃菌属、梭杆菌属，梭菌，Bilophila, and Sutterella.L 不能用临床标本直接做药敏3常规厌氧菌药敏方法1） - 内酰胺酶除脆弱拟杆菌外的菌在做药敏试验前都应检测内酰胺酶试验。决大多数脆弱拟杆菌都产内酰胺酶，应报告青霉素、阿莫西林和氨苄西林耐药。2 ）E-test方法重症，血培养来源的厌氧菌适用。E-test方法是琼脂稀释法的替代方法，注意判读结果时尽量保守，否则容易出现“非常主要错误”。E-test方法是精确和实用的药敏试验方法。3）其他适合临床使用的商品药敏系统Dubreuil等评价ATB ANA(Version 96)系统（生物梅里埃）与琼脂稀释法对200株临床分离厌氧菌对9种抗生素的结果后指出，ATB ANA是临床做厌氧菌药敏试验非常方便的方法， 结果与参考方法较符合。此系统可按照法国临床微生物学会抗生素分会和NCCLS两种标准解释结果。六、报告结果初级报告最终报告