流式细胞术的样品制备.doc

第二节　流式细胞术的样品制备

　　节概述

　　待测标本的制备是流式细胞术分析的关键，本节分别直接免疫荧光标记、间接免疫荧光标记、微量全血法免疫荧光标记、双标记、培养细胞DNA荧光标记以及细胞凋亡检测样品的制备。

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　　1.直接免疫荧光标记的样品制备　
　　用标有荧光素的特异抗体对细胞进行直接染色，然后用流式细胞仪检测，阳性者即表示有相应抗原存在。实验步骤如下：
　　(1)每份取100 μl单细胞悬液(细胞密度约1×106个细胞)。
　　(2)一份加入相应量的异硫氰酸荧光素或藻红蛋白标记的特异性荧光直标单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗作为阴性对照样品。
　　(3)室温下避光反应一定时间(时间长短根据试剂说明书要求进行)，一般在室温下反应15～30min即可。
　　(4)加入500 μl磷酸缓冲液重悬成单细胞悬液即可上机检测。
　　2.间接免疫荧光标记的样品制备
　　(1)取1×106个细胞/100μl，先加入一抗混匀，置室温下避光反应30 min。
　　(2)用PBS洗涤细胞2次，离心沉淀弃掉上清液(离心转数一般为800～1000 r/min，5 min)。
　　(3)用100 μl PBS重悬细胞，再加入FITC或PE标记荧光二抗(用量均按说明书要求加入)混匀，室温下反应30 min。
　　(4)用PBS再洗涤细胞2次，加入500 μl PBS重悬成单细胞悬液，上机检测。
　　注意：以上两种染色方法的抗体加入量和反应时间，没有非常具体的规定，一般应根据试剂使用说明书的要求进行。若说明书上未说明，应先进行预实验，掌握好剂量与最佳反应时间后，再进行流式样品的制备。制备好的样品，若不能及时上机检测，用1％～4％的多聚甲醛固定，4℃下可保存5d。
　　3.微量全血法免疫荧光标记的样品制备
　　目前制备全血细胞样品的方法很多，且很成熟，常用的方法是用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，然后进行特异性荧光染色，其染色方法与前面介绍的方法相同。下面主要介绍与流式细胞仪配套的QPREP(免疫学样品处理器)进行快速制备微量全血样品的方法：
　　(1)微量全血直接荧光染色法：具体方法为①取肝素或EDTA抗凝全血100 μl置12 mm×75 mm专用塑料试管中；②每份加入20 μl特异性荧光单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗作阴性对照，室温下避光染色15 min；③置 Q PREP 仪上溶解红细胞、稳定和固定白细胞，静置5 min；④上流式 细胞仪检测。
　　(2)微量全血间接荧光染色法：具体方法为①取肝素或EDTA抗凝全血100 μl置12×75 mm专用塑料试管中；②加入50 μl特异的第一单克隆抗体，室温下孵育30 min；　③ 置QPREP仪上溶解红细胞，稳定和固定白细胞；④离心(800～1000 rpm，5 min)弃上清液，用PBS洗涤细胞2次；⑤加入50 μl荧光(FITC或PE)标记的第二抗体，室温下避光染色30 min；⑥上流式细胞仪检测。
　　　(3)注意事项：①新鲜全血保存时间：一般室温下放置8 h以内可以使用，时间过长会使活性降低，影响测定结果；②抗凝血应保证无血块凝集；③全血加入试管中时，应尽量避免加到试管壁上，如沾到了管壁上必须用棉签擦干净，否则会影响细胞二维点图的细胞群的分离效果。
　　4.双标记(双染色)直接免疫荧光的样品制备
　　在流式细胞术分析中，由于双参数分析的光谱重叠现象和干扰因素相对增多，一般不采用间接荧光法制备细胞样品而是用直接法进行双标记染色。目前双标记的荧光探针较多，但一般采用FITC与PE标记的单抗组合，在进行双标记荧光染色的样品制备中，由于前面已述及到荧光补偿等问题，因此，不仅要制备阴性对照样品，而且必须制备阳性对照样品，以此先调整好流式细胞仪的工作参数，使测量得到的数据准确可靠。
　　全血的样品制备实验步骤如下：
　　(1)取肝素或EDTA抗凝人外周血样品100 μl(2份)。
　　(2)1份加入CD4FITC/CD8PE的双标荧光抗体；另一份加入MsIgG1FITC/MsIgG1PE鼠抗人无关单抗(作阴性对照)混匀。在室温下避光染色15 min。
　　(3)置QPREP样品制备仪上，快速自动溶解红细胞，稳定和固定白细胞。
　　(4)阳性对照样品的制备，取100 μl肝素抗凝正常人全血，加入CD4FITC/CD8PE双标荧光单抗，染色法与2、3步骤相同。
　　(5)将制备好的样品上流式细胞仪检测。
　　5.培养细胞DNA荧光染色的样品制备
　　(1)培养细胞用0.25％的胰酶消化。
　　(2)PBS或生理盐水洗涤细胞2次，再用PBS或生理盐水悬浮细胞，加入预冷的无水乙醇，终浓度为(60％～70％)，快速混匀，并用封口膜封口，置4℃下可保存15 d左右。
　　(3)将固定过的细胞离心(800～1000 r，5 min)弃上清液，再用PBS洗涤2次。
　　(4)用PBS调整细胞浓度，每份为1×106个细胞/100 μl。
　　(5)加入500 μl DNA 荧光染料(通常用Coulter公司提供的DNA染色试剂盒)室温下避光染色15
min。
　　(6)上流式细胞仪检测。
　　以上样品的制备可分析细胞周期各时相的百分比，同时可粗略观察有无细胞凋亡现象，如果用对照液(鸡红细胞)作参照标准，可进行细胞DNA倍体分析。染色后的细胞在4℃可保存2 d，荧光强度保持不变。
　　6.细胞凋亡检测样品的制备
　　(1)悬浮细胞凋亡样品的制备：使用 ANNEXIN VFITC 细胞凋亡检测试剂盒，根据Annexin V与磷脂酰丝氨酸(含有碘化丙啶)的结合特性来检测细胞凋亡发生的情况。具体方法为：① 将10×的结合缓冲液用蒸馏水稀释成为1倍稀释，冰育；②悬浮细胞在低温环境中，用PBS洗涤细胞2次(800～1000 r离心，5 min)；③弃上清，加入预冷的结合缓冲液重悬细胞(细胞浓度为105～106／ml)；④加入5 μl Annexin VFITC和5 μl PI(碘化丙啶)于细胞悬浮液中，轻轻混匀；⑤ 将试管置于冰上，避光孵育10 min；⑥ 上FCM检测。
　　(2)贴壁细胞凋亡样品的制备如下：①24孔板每孔500 μl培养液培养细胞。根据实验方案诱导细胞凋亡。②加入5 μl Annexin VFITC于含1.5 mmol/L CaCl2的细胞培养液中，0℃～37℃孵育10 min。③收集细胞前用含1.5 mmol/L CaCl2的培养液洗涤2次。④用Rubber policeman 收集细胞。⑤用含1.5 mmol/L CaCl2培养液或1倍稀释的结合缓冲液重悬细胞。⑥加入终浓度为2.5 μg／ml的PI(碘化丙啶)，轻轻混匀，置冰上孵育15 min。⑦上流式细胞仪检测。
　　7.样品制备应注意的问题和影响因素
　　(1)样品制备应注意的问题:①单细胞悬液的制备是流式细胞术分析的关键，一般每份样品要求的 细胞数为5×105～1×106。如遇有细胞团块应先用300～500目的细胞筛网过滤后，再上机检测。②用消化酶液消化细胞应注意掌握酶的适当浓度、温度及pH值。③免疫荧光标本应注意死细胞和碎片的去除，尤其是稀少细胞或细胞亚群的测定时，否则这些细胞的非特异性荧光增加，会干扰免疫荧光测定。④对脱落细胞制备单细胞悬液，要慎重分析和解释结果的生物学意义，因为这些结果常出现阴性或假阳性结果，这是由于其中的白细胞常有变性。因此，要求每份样品中杂质、碎片、团块重叠细胞应在20％以下，对肿瘤细胞DNA异倍体的样品分析，至少应有20％的肿瘤细胞存在(占主峰1/5以上的异倍体才可确认为异倍体峰)。
　　(2)影响样品制备的因素:①温度对荧光强度的影响：一般认为，温度升高时荧光减弱，所以在荧光测量时要保持染色后的样品在适当低温环境下进行，并尽可能减少样品的光照射时间。　有条件时，应使样品观察室达到恒温，使温度对荧光染色的影响减少到最小，会得到更好的荧光定量测定的结果。②pH值对荧光强度的影响：每一种荧光染料分子发光的最高量子产额，都有自己最适合的pH值，以保持荧光染料分子与溶剂间的电离平衡，如果pH值发生改变，可能造成荧光光谱的改变，如FITC在酸性溶剂中呈蓝色荧光，为阳离子发光，而在碱性溶剂中呈黄绿色荧光，为阴离子发光。