人重组白细胞介素-8在大肠杆菌的表达、鉴定.doc

人重组白细胞介素-8在大肠杆菌的表达、鉴定
【摘要】目的 利用PCR技术扩增hIL-8 cDNA，将其连接于原核表达载体pKpL-3a（含PL启动子）中,并在大肠杆菌中表达、鉴定。方法 PCR技术扩增hIL-8 cDNA获取目的基因，将该基因重组到大肠杆菌表达载体pKpL3a质粒中，重组DNA分子转化到Pop2136大肠杆菌中，利用其所产生的温度敏感性λ阻遏蛋白来调控外源基因表达，经ELISA反应检测其表达水平。结果 带hIL-8基因的重组pKpL3a质粒成功转化到Pop2136大肠杆菌中，经诱导，表达了IL-8并经ELISA反应检测了其表达水平。结论：hIL-8成功在大肠杆菌中表达。
【关键词】hIL-8 PCR 重组基因 表达
正文
趋化因子（Chemokine）是一组具有趋化作用的细胞因子，能吸引免疫细胞到免疫应答局部，参与免疫调节和免疫病理反应。白细胞介素-8（Interleukin-8）属于趋化因子家族成员，其分子中含有Cys-X-Cys的三联氨基酸序列，因而属于CXC趋化因子亚家族（α家族）。IL-8的重要生物学功能是对中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞具有区划作用，并可促进中性粒细胞的活化，在炎症反应中是一种重要的炎症因子。另外，IL-8还具有促进造血细胞增殖及新生血管生成作用，在伤口愈合和肿瘤生长及转移的过程中发挥重要作用。
由于天然来源的IL-8含量极低，难以大批量制备，因而只能利用基因工程技术进行表达和生产。其基本过程是：获取目的基因；表达载体的选择和构建；目的基因与表达载体的拼接；重组DNA分子转化到大肠杆菌；使其复制转录并合成重组的免疫分子。利用重组技术, 可使大肠杆菌成为生产IL-8的生物工厂。这种生物工厂一旦建造成功, 只要供给大肠杆菌适当的生长条件, 就可提供取之不尽的IL-8。
1 材料与方法
1.1 主要材料
1.1.1 菌株与载体
Pop2136大肠杆菌和含pKpL-3a质粒的大肠杆菌由本实验室提供。
1.1.2 工具酶与试剂
TaqDNA聚合酶及其buffer购于北联生物医学工程公司。dNTPmix购于Takara公司。Klenow酶购于北联生物医学工程公司。内切酶StyⅠ、XbaⅠ购于Takara公司。T4 DNA连接酶及其buffer购于Takara公司。
1.1.3 PCR引物的设计、合成
上游5ˊ引物：agt gct aaa gaa ctt aga tgt；
下游3ˊ引物：ccg tct aga tta tga att ata agc cct ct(内含XbaⅠ酶切位点和TAA终止密码)由Takara公司合成。
1.1.4 主要仪器
PCR仪，微量加样器（20μl、200μl、1000μl），高速台式离心机，DYY-10型电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统，水浴摇床，孵箱，酶标仪，一次性酶标板等。
1.2 试验方法
1.2.1 PCR技术扩增hIL-8cDNA
在Eppendorf管中依次加入下列成份构建总体积为50μl的反应体系：ddH2O 37μl、10×buffer 5μl、dNTPmix 5μl、上游引物1μl、下游引物1μl、cDNA模板1μl、Taq酶 1μl。调节PCR仪，设置95℃预变5分钟。 94℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，反应30个循环。最后72℃再延伸5分钟。在设定好的PCR仪上进行反应。反应结束后取出10μl进行琼脂糖凝胶电泳。向管中余下的40μl反应体系中加入Klenow酶 1μl，室温30分钟，以修平扩增片段的3ˊ末端。之后转至1.5ml离心管中，加入50μl酚-氯仿-异戊醇并混匀，10000rpm，30秒离心。吸取上层清液转至另一已加入5μl 3M NaAc的1.5ml离心管中，加入150μl无水乙醇，-20℃放置1小时。10000rpm，10分钟离心，弃上清，加入0.5ml 70%乙醇，10000rpm，5分钟离心，弃上清，空气中干燥，溶于20μl TE。
1.2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳
配置0.8%琼脂糖凝胶板。充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入TAE（×1），使其液面略高于琼脂糖板，拔出样品梳。DNA样品10μl加5μlGEBS样本液，在蜡面纸上混匀，全部加样于琼脂糖的样品孔中。稳压电泳80v约2小时，是溴酚蓝指示剂泳动到适当位置，1-5v/cm。取出凝胶板置溴化乙锭中染色20分钟。在凝胶成像仪观察结果。
1.2.3 质粒提取
从转化平皿上接种一单菌落到LA培液体养基中，37℃震荡培养，待细菌浓度增至OD600=1.5时，收获细菌。取菌液1ml转至Eppendorf管中，8000rpm，2分钟离心，弃上清。加入200μl缓冲液A，充分混匀。加200μl碱溶液裂解细菌，反复倒转管5次至溶液清亮，开盖后能拉出丝状粘稠液体。加200μl乙酸缓冲液，反复倒转管5次混匀，冰浴10分钟（宁短勿长）。10000rpm 5分钟离心，上清转至另一Eppendorf管中，加2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置1小时。10000rpm 5分钟离心，弃上清，加入70%乙醇0.5ml。10000rpm 5分钟离心，弃上清，干燥。加入50μl TE使质粒溶解，酶切备用。
1.2.4 限制性内切酶消化
取两个Eppendorf管分别标记A、B，依次加入下列物质构建两个反应体系。A管：ddH2O 16μl 、10×H buffer 2μl、质粒DNA 1μl、StyⅠ1μl。B管：ddH2O 14μl 、10×M buffer 2μl、0.1%BSA 2μl、PCR产物1μl、XbaⅠ1μl。37℃水浴45分钟。
A管中加入1μl Klenow酶、2μl dNTPmix，室温30分钟，加50μl酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000rpm 5分钟离心，取上层液转至另一Eppendorf管中，加100μl无水乙醇、4μl乙酸钠，混匀，-20℃沉底1小时。10000rpm 10分钟离心，弃上清，100μl 70%乙醇洗涤一次，干燥。加入2μl 10×M buffer、2μl 0.1%BSA、1μl XbaⅠ，37℃水浴45分钟。加50μl酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000rpm 5分钟离心，取上层液转至另一Eppendorf管中，加100μl无水乙醇、4μl乙酸钠，混匀，-20℃沉底1小时。10000rpm 10分钟离心，弃上清，100μl 70%乙醇洗涤一次，干燥。加20μl TE进一步用于连接反应。
B管中加50μl酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000rpm 5分钟离心，取上层液转至另一Eppendorf管中，加100μl无水乙醇、4μl乙酸钠，混匀，-20℃沉底1小时。10000rpm 10分钟离心，弃上清，100μl 70%乙醇洗涤一次，干燥。加20μl TE进一步用于连接反应。
1.2.5 DNA连接
在Eppendorf管中加入下列物质构建反应体系进行连接反应：H2O 9.5μl、10×T4 DNA连接酶buffer 2.5μl、pKpL3α质粒DNA 7μl、IL-8 PCR产物5μl、T4 DNA连接酶1μl。置12-16℃水浴反应过夜。65℃水浴15分钟，灭活T4 DNA连接酶，用于转化。
1.2.6 转化
将无质粒大肠杆菌pop2136接种于1ml LB培养基37℃培养3-5小时。待OD600=0.4时转移至Eppendorf管中，8000rpm 2分钟离心，弃上清。加200μl 100mM Cacl2混匀，冰浴30分钟。加10μl连接好的质粒DNA，混匀，冰浴30分钟，37℃水浴2分钟，冰浴2分钟。加入1ml LB培养基，37℃培养0.5小时。取出50μl涂于LA培养皿上（含氨苄青霉素），37℃倒置培养过夜，检查转化菌是否生成(只有转化的细菌才能在平皿上生长)。
1.2.7 细胞因子的测定—ELISA双抗体夹心法
包被：将稀释好的包被抗体加入ELISA板，100μl/孔，放置湿盒中，4℃ 24小时。洗涤：加入洗涤液洗涤1分钟/次，共3次。加样：加入待测样品、阴性对照及倍比稀释的标准品，100μl/孔，放置湿盒中，37℃ 30分钟。洗涤：同前。加酶标抗体：100μl/孔，100μl/孔，放置湿盒中，37℃ 30分钟。洗涤：同前。加显色剂：A液（TMB，四甲基联苯胺）1滴，B液（H2O2）1滴，室温显色5-10分钟。终止反应：加中止液（2mol/L H2SO4）。测OD值：酶标仪测450nm处OD值，以OD值为横坐标，标准品浓度为纵坐标绘制标准曲线。
2 结果
2.1 DNA琼脂糖凝胶电泳见图1。
检查扩增结果9组都见一致的扩增区带，PCR产物与设计的228bp相符，并无非特异性扩增，说明目的基因扩增成功。

1 2 3 4 5 6 7 8 9

图1 DNA琼脂糖凝胶电泳分析
注：PCR Products:228bp

2.2 ELISA双抗体夹心法检测IL-8含量所测OD值和标准曲线见表1和图2。
表1 450nm处OD值

4组

Measurement count: 1 Filter: 450

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A

B

0.81
0.485
0.914
1.654
0.445
0.614
1.7
0.241
1.503
0.155

C

0.735
0.633
0.939
1.702
0.449
0.364
1.415
0.383
1.412
0.754

D

0.836
0.618
0.921
1.237
0.366
0.384
1.339
0.352
1.481
0.261

E

0861
0.747
1.169
1.84
0.358
0.575
0.343
0.542
0.226
0.11

F

0.321
1.198
1.51
2.136
0.704
0.882
0.704
1.108
0.55
0.192

G

0.377
1.565
2.198
1.876
0.448
0.654
0.612
0.949
0.915
0.408

H

图2 ELISA双抗体夹心法标准品OD值标准曲线
根据标准品的浓度和试验所测OD值，计算出待测样本的hlL-18浓度为10.4ng/ml。
3 讨论
本实验首先通过PCR技术扩增hlL-18cDNA，反应结束后取出少量做琼脂糖凝胶电泳，根据图1的结果可以看出，引物的设计和PCR反应条件的设计是很成功的。而在PCR反应中，引物的设计尤为重要。引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补；其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；再次引物不能在模板的非目的位点引发ZML聚合反应（即错配）。具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素。引物的长度一般为15~30bp，常用的是18~27bp，但不应大于27bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应[1]；引物序列在模板内应当没有较高相似性片段，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配[1]；末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A；引物序列的GC含量一般为40%~60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大［2］; 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4（G+C）+2(（A+T）; 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。而本试验酶切位点设计在下游3’引物上，并且增加了ccg三个碱基来保护酶切位点，是酶切更高效[3]。
把PCR产物和提取的质粒DNA进行限制性内切酶消化，然后进行DNA的连接。将hlL-8cDNA片段插入pKpL3α质粒中，有三种方法可选。一是两个平端连接；二是两个粘端连接；三是一个平端和一个粘端连接。分析这三种连接方法，第一种方法优点是设计简单，但是缺点也很明显，连接反应慢、片段位置易倒置、容易形成多个重复序列等。第二种方法优点是连接紧密，特异性高，但酶切位点设计比较复杂。所以综合以上情况，本实验采用第三种办法。3’端用Klenow酶补齐，5’端用XbaⅠ进行酶切，使之产生互补粘端。经过转化处理后，小批量诱导hlL-8表达，经纯化后，进行ELISA双抗体夹心法检测，由图2可以大致估算出hlL-8的浓度[4]。
另外，经转化的大肠杆菌在LA平皿上进行培养，长出的大肠杆菌说明其细胞均内含有质粒，但不能说明其质粒中都含有目的基因片段。所以要对培养出的大肠杆菌做进一步的鉴定。由于本实验没有做这一步，所以有必要在这里讨论一下。挑单个菌落接种于1ml LA培养基中，30℃培养后可进一步提取质粒进行DNA电泳；或者用限制性内切酶酶切后进行DNA电泳，看是否含有目的基因片段。还可以小批量诱导重组IL-8表达，然后进行SDS-PAGE电泳，鉴定重组蛋白的分子量。
本试验成功地构建了hlL-18重组原核表达质粒，利用大肠杆菌成功地表达了重组蛋白，为进一步研究hIL-18的功能及应用打下了基础。
参考文献
[1] 张成岗，贺福初. 生物信息学方法与实践[M]. 北京：科学出版社，2002, 64,-66.
[2] 贺林. 解码生命-人类基因组计划和后基因组计划[M]. 北京：科学出版社，2000, 346-348.
[3] 张新宇，高燕宁. 生物信息学[J]. 2004(04): 16-19.
[4] 分子免疫学实验指导.