细菌内毒素检验操作程序.doc

山 东 天 力 药 业 有 限 公 司
标题：细菌内毒素检测操作程序
编号：SOP-QM-243-B
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分发部门：品质部、中心化验室、过程分析室
目的：规范细菌内毒素检验操作程序。
范围：适用于细菌内毒素检查操作。
责任：品质部组织制定，中心化验室负责实施。
内容
1准备工作
1.1实验设备及用具
1.1.1刻度吸管、称量瓶、镊子、安瓿瓶（2ml、5ml）、药匙、250℃烘烤1小时。
1.1.2干燥箱、恒温水浴锅、漩涡混合器、精密天平。
1.1.3剪刀、砂轮片、医用胶布、洗耳球、试管架、脱脂棉球、水银温度计、试管
1.2内毒素标准品与实验试剂
1.2.1鲎试剂：在使用前应进行灵敏度测定，原则上购进一个批号测定一次。
1.2.2细菌内毒素检查用水（内毒素含量＜0.015Eu/mL灭菌注射用水）。
1.2.3细菌内毒素国家标准品和工作标准品。
1.2.4 75%乙醇、铬酸洗液。
1.3实验用具的消毒处理：凡是参与实验样品或试剂接触的器具，在实验前必须经除细菌内毒素处理，将洗净的器具经纯化水冲洗后，在250℃干热灭菌至少60分钟。
1.4恒温水浴箱内水浴温度调节到37±1℃。
2鲎试剂灵敏度复核
2.1根据鲎试剂灵敏度的标示值（如：λ=0.25 EU/ml），细菌内毒素工作标准品加入1ml细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟。
2.2将工作标准品制备成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度（0.5 EU/ml、0.25 EU/ml、0.125 EU/ml、0.06 EU/ml）的内毒素标准溶液，备用。
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例：工作标准品为160 EU/ml时
160EU/ ml
标准品溶液
0.2ml
16EU/ ml
0.5ml
8EU/ ml
0.5ml
1.8ml
0.2ml
1.4ml
1EU/ ml
0.9ml
0.9ml
0.5EU/ ml
0.9ml
0.9ml
0.25EU/ ml
0.9ml
0.9ml
0.125EU/ ml
0.9ml
0.9ml
0.06EU/ ml

注意：每稀释一步均应在混合器上混匀30秒。
2.3取18支0.25 EU/ml鲎试剂，每支中加入0.1mlBET 水，然后分别加入0.1ml2.2中制备好的4个浓度的标准液,按浓度从高到低依次加入，每个浓度加4支，；最后2支加入0.1mlBET 水作阴性对照。
2.4将上述试管用医用胶布封口，垂直放入37℃±1℃水浴锅中，保温60±2分钟。放入水浴前把水搅动几下，以使水温均匀。再次检查温度是否在所要求的范围，注意保温和取放过程应避免受到振动造成的假阴性结果。
2.5保温结束后将试管轻轻取出，缓缓转到180°，若关内形成凝胶，不变形、不从管壁滑落者为阳性；未形成凝胶或形成凝胶变形从壁滑落者为阴性。（注意：保温盒拿取试管过程应避免受到震动而造成的假阴性结果）
2.6 结果判定
当最大浓度2λ4支管均为阳性，最低浓度0.25λ4支管均为阴性，阴性对照2支管为阴性，实验方有效。如图1

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按下述公式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值λc。
λc=
antilg(Σx/4)
当λc在0.5λ-2λ时，方可用于细菌内毒素的检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

式中：X为反应终点浓度的对数值lg。反应重点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。antilg是lg函数的反函数，在excel里可以用power公式，power（数值）

2.7举例
设待复核鲎试剂的灵敏度为0.25 EU/ml，即λ=0.25 EU/ml。实验结果如下：
内毒素浓度  （EU/ml）  0.50   025  0.125  0.062  Nc     反应终点浓度X
1 + + - - - 0.25
2 + - - - - 0.50
3 + + + - 0.125
4 + + + - 0.125

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则：
λc =antilg(∑X/4)
=antilg[（lg0.25＋lg0.50＋lg0.125＋lg0.125）/4]
= antilg[(-0.602-0.301-0.903-0.903)/4]
= antilg(-0.508)=0.310（EU/ml）
λc在0.5λ-2λ范围内，符合规定。
结果不是内毒素最大浓度（2λ）4管全部阳性，最小浓度（0.25λ）4管全部阴性，本批鲎试剂不能使用。需查找原因，可能是灵敏度标示不准确或内毒素效价标示不准确，或操作不当所致。
3.干扰实验
干扰试验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。
3.1制备内毒素标准对照溶液
取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ。
3.2制备含内毒素的供试品溶液
将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将11.1中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液。
3.3鲎试剂的准备
取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按其标示量加入检查用水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混和在一起，然后每0.1ml分装到10×75mm凝集管中，要求至少分装36管备用。
3.4凝胶反应
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将准备好的鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准对照液，另一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。将另外18支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的含供试品溶液；另一列2支（管）加入0.1ml供试品溶液作为样品阴性对照，如表1所示。加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，两同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，保温60±2分钟后，观察并记录结果。
表l 凝胶法干扰试验溶液的制备
编号
内毒素浓度/被加入内毒素的溶液
稀释用液
稀释倍数
所含内毒素的浓度
平行管数
A
无/供试品溶液
——
——
——
2
B
2λ/供试品溶液
供试品溶液
1
2λ
4
2
1λ
4
4
0.5λ
4
8
0.25λ
4
C
2λ/检查用水
检查用水
1
2λ
4
2
1λ
4
4
0.5λ
4
8
0.25λ
4
D
无/检查用水
——
——
——
2
注：A为供试品溶液；B为干扰试剂系列；C鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。
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3.5判定并计算C和B的反应终点浓度的集合平均值(Es和Et)
只有当溶液A 和阴性对照溶液D 的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C 和B 的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et ) :
Es= antilg （∑Xs / 4 )
Et=antilg （∑Xt / 4 )
式中Xs、Xt分别为系列溶液C 和溶液B 的反应终点浓度的对数值（lg）。
当Es在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及Et在0.5Es～ 2 Es （包括0.5Es和 2 Es）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD 的进一步稀释，再重复干扰试验。
可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。
当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。
当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
3 供试品细菌内毒素检查凝胶限度试验
4.1要求：在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做2支供试品和2支供试品阳性对照，同时每次试验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。
4.1.1因《药典》对甘露醇原料药内毒素无要求，参照甘露醇注射液内毒素限值，每1g甘露醇中含内毒素的量应小于1.25EU。
根据MVD=CL/λ ，且当供试品为注射用原料药时，MVD取1。故20%甘露醇注射液的鲎试剂限度为： λ=0.2g/ml×1.25EU/g=0.25EU/ml
4.2操作方法
4.2.1供试品溶液的制备
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准确称取0.2甘露醇用1mlBET水溶解，制成20%甘露醇溶液。
根据MVD=CL/λ，将供试品进行稀释，其稀释倍数不得超过MVD。
式中：C为供试品浓度。
L为供试品的细菌内毒素限值。
λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度。
例：①当用标示值为0.25EU/ml灵敏度的鲎试剂时，MVD=CL/λ=20%×1.25/0.25=1(倍),所以把供试品制成20%的稀释液即可。
②当用标示值为0.125EU/ml灵敏度的鲎试剂时，MVD=CL/λ=20%×1.25/0.125=2(倍),所以把供试品制成10%的稀释液即可。
③当用标示值为0.06EU/ml灵敏度的鲎试剂时，MVD=CL/λ=20%×1.25/0.06=4(倍),所以把供试品制成5%的稀释液即可。
4.3阳性对照溶液的制备
用检查用水将内毒素标准品稀释制成2λ浓度的内毒素标准溶液。
取规格为10EU的细菌内毒素标准品一支 用酒精棉球将瓶颈消毒后开启，加BET检查用水1.0ml混合15分钟后备用。
例：当用标示值为0.25EU/ml灵敏度的鲎试剂时，2λ=0.5EU/ml，

10EU/ ml
标准品溶液
0.2ml(10EU/ml标准品溶液)
1．0EU/ ml
1.0ml(1.0EU/ml标准品溶液)
0.50EU/ ml
1.0mlBET
1.8mlBET

例：当用标示值为0.125EU/ml灵敏度的鲎试剂时，2λ=0.25EU/ml，

10EU/ ml
标准品溶液
0.2ml(10EU/ml标准品溶液)
1．0EU/ ml
1.0ml(1.0EU/ml标准品溶液)
0.50EU/ ml
1.0mBET
1.8mlBET
1.0ml(0.50EU/ml标准品溶液)
1.0mBET
0.250EU/ ml

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4.4供试品阳性对照溶液的制备
用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度的内毒素溶液。
例：当用标示值为0.25EU/ml灵敏度的鲎试剂时，2λ=0.5EU/ml，

10EU/ ml
标准品溶液
0.2ml（10EU/ml标准品溶液）
1．0EU/ ml
1.0ml(1.0EU/ml标准品溶液)
0.50EU/ ml供试品阳性对照溶液

1.0ml（20%供试品溶液）
1.8ml（20%供试品溶液）

例：当用标示值为0.125EU/ml灵敏度的鲎试剂时，2λ=0.25EU/ml，
10EU/ ml
标准品溶液
0.2ml(10EU/ml标准品溶液)
1．0EU/ ml
1.0ml(1.0EU/ml标准品溶液)
0.50EU/ ml
1.0ml（10%供试品溶液）

1.8ml（10%供试品溶液）
1.0ml(0.50EU/ml标准品溶液)
1.0ml（10%供试品溶液）

0.25 EU/ml供试品
阳性对照溶液

4.5阴性对照液即细菌内毒素检查用水
4.5.1鲎试剂的准备
取规格为0.1ml的鲎试剂8支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后开启备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解。
4.5.2加样
取8支2.2.5溶解好的鲎试剂，其中2支加入0.1ml供试品溶液，作为供试品管；2支加入0.1ml阳性对照溶液，作为阳性对照管（PC）；2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液，作为供试品阳性对照管（PPC）；2支加入0.1ml检查用水作为阴性对照管（NC）。
试验加样如：（单位ml）
参照管
试剂
供试品管
阳性对照PC
供试品阳性对照PPC
阴性对照NC
1
2
1
2
1
2
1
2
鲎试剂
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1

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供试品液
0.1
0.1

BET用水

0.1
0.1
供试品阳性对照液

0.1
0.1

阳性对照液

0.1
0.1

4.5.3将2.2.6试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37℃±1℃水浴锅
中，保温60±2分钟。注意保温和取放过程应避免受到振动造成的假阴性结果。
4.6结果判断
当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时，试验方为有效。若供试品2管均为阴性，认为该供试品符合规定；如若供试品2管均为阳性，认为该供试品不符合规定；如2管中1管为阳性，另1管为阴性，则必须领取4支供试品管复试，4管中如有1管为阳性，即认为不符合规定。
5修改记录
验证/更改日期
更改内容
被更改版本号
新版本号
新版本生效日期
2010.9.1
进一步细化
A
B
2010.10.1