使用毛细管的方法又成为滴点(Sample spotting)将滴.pdf

實驗報告 色 層 分 析 法 化 材 二 乙 第 四 組 實驗組員：49840054 邱儀郡 49840060 林郁汶 49840063 李紫嫻 49840065 劉哲妏 49840095 侯哲學 49840098 劉勇顯 49840099 柯政漢 49840100 陳憲毅 原理:色層分析分為兩種:氣相色層分析(Gas chromatography)與液相色層分析(Liquid chromatography),本實驗僅介紹薄層分析(Thin layer chromatography)、管柱色層分析(Column chromatography)及濾紙色層分析(Paper chromatography)三種液相色層分析。色層分析可用來作多種混合物的純化與分離工作亦可作其定性及定量上的分析，不像一般蒸餾、萃取、結晶等物理分離操作有所限制。最初色層分析只能利用物質本身的不同顏色而予以辨認分離,現在則對於無色物質亦可分離。色層分析的分離,是利用欲分離物質與具有多孔性色層分析儀器內物質的吸附性(或分配率)的差異,將混合物內物質加以分離;亦即利用試樣中各物質在靜相(Stationary phase)及移動相(Mobile phase)間的差別移動,而將各物質分離。如果分析儀內物質是裝置於管柱內,則稱之為管柱色層分析。如將吸附性固體均勻散布在一薄層上此為薄層色層分析。此外對於少量物質的分離常用紙層色層分析。(一)薄層色層分析法(TLC):TLC 是定性分析最有效的方法,只需用少量的混合液(試料)加到薄板的一端,再選用適當溶劑予以沖提(Elution)就可以將混合物分離到不同的位置,再檢驗各別位置的距離則便能確認各物質的種類了,整個 TLC 裝置可由圖 8-1 表示;所謂沖提(Elution)就是從吸附劑拉開溶質的力;亦及混合物內各溶質溶於移動相(展開溶劑)並隨之移動之力的現象。一般常用的吸附劑(Adsoption agent)(在此色層分析內,以吸附劑薄膜為固定相)有矽膠(Silicongel)凝體 G 組,矽膠凝體G 組加上接合劑(常用硫酸鈣 CaSO4),纖維素細粉、礬土(Alumina)以及 Florisil等。TLC 板可用很細的毛細管沾混合液在板的一端如圖 8-3 所示,通常點上三點,以利觀察。使用毛細管的方法又成為滴點(Sample spotting)。將滴點後的 TLC 板置於如圖 8-1 TLC 裝置,開始延展作用(即沖提作用),需注意點上混合液的一端朝下,但不能使展開溶劑之液面超出混合液的滴點(即滴點須距離展開溶劑 2cm處)。尚展開溶劑到達離 TLC 板上層約 1cm 處就可取出 TLC 板,然後檢驗各分散點所代表的化合物種類了。展開溶劑的選擇為展開速率最大的影響因素,且展開劑須絕對精純,展開溶劑依分析的種類有所不同,一般可分成兩類:(1)金屬離子用:丙酮:正丁醇:濃鹽酸的混合液(體積比 5:2:1)且須在配製後一星期內使用。(2)胺基酸根用 乙酸:正丁醇:水的混合液(體積比 1:4:5)且需在配製後一星期內使用 展開溶劑的溶解力的適當選擇非常重要,可參考表 1,表中有關常使用溶劑的極性;在作呈色檢驗前,須注意觀察展開情況良好與否,如果發現不易作檢驗的展開點,則須重新加以修正、展開。例如發現色點展開後有重疊拖尾(Tail)現象時須將薄膜刮鏟成圖 8-2 形狀。則展開劑經過狹窄區域後流動方向即可改變,使色點呈長帶狀而不再呈圓形。此外可藉用雙向展開來鑑定是否有分解作用(Decomposition)通常展開溶劑選用適當;可將原滴點分出一連中的小點(每一小點代表每一種化合物)如圖 8-3 所示。如果成份物質係無色者則使用一適當顯色劑噴灑以識別之。同常檢定色點都以各成份物質的 Rf值(Rate of flow)作定性分析,已判定為何種化合物;由於彼此各成份逐漸分離而形成層帶,層帶移動距離與展開溶劑前沿移動距離的比值為移動率,以 Rf表示(如圖 8-3 所示)。的距離原點線到展開劑前端線離原點線到斑點中心的距展開劑前沿移動的距離層帶移動距離fR 一般,各成份 Rf值的差在 0.1 以上,即可加以分離之。檢驗用的顯色劑,常用碘蒸氣來顯色,因為幾乎所有化合物吸附碘後都形成紫色或棕色的斑點,而斑點的密度並不代表各化合物的含量,因為各化合物與碘的反應程度不同。另一種方法是由 U.V 燈(紫外線)來照射以顯色。第三種方法是在吸附層上加上少量螢光劑以顯色,市售含胺基酸飲料(如保力達、達益寧、保力他命等)則可用 2%Ninhydrin 的正丁醇溶液予以顯示。(二)濾紙層析法(PC):PC與 TLC分析法原理大致相同,在 PC的分析中(如圖 8-4 所示)以濾紙及所吸附的水作為固定相;主要是因為濾紙內的纖維素對水有強的親和力,即使乾的濾紙亦含有約 12%的水份,具有相當的吸附作用(Adsorption)。如果欲分離微量的物質,通常選濾紙色層分析法(濾紙取代薄層色層分析中的薄層),不論使用何種分析,均須先以展開液的飽和液進行展開作用,而且須在密閉容器內進行,否則將因有機溶劑的揮發而導致液相的改變,影響分離前後 液相均一性,使移動率 Rf發生變化。使用毛細管滴點時,須使滴點在濾紙上的滴點直徑約為 25mm,且不能使滴點在濾紙上擴散,通常選較細的毛細管以利操作。(三)管柱色層分析(CC):CC作用類似多次萃取,其萃取次數與管柱內高度相當如圖 8-5 所示,利用不同溶質在靜相與動相不同的吸附力(萃取中的分配係數)而分離,若較易溶於動相的溶質移動速率較快,較易溶於靜相者移動速率較慢,因此可將混合液內各成份分離出來。右圖所述的系統,僅是一種近似的分析程序,而真正的色層分析中,並無法真的區分為若干萃取階段。在 C.C 中,係以一種活性固體吸附劑置於管柱內當作靜相,而將欲分離的混合液置入管柱上端流下,同時以適當溶劑當移動相從管柱上端加入,則藉著沖提作用(Elution)及吸附劑同時對溶劑及溶質吸附力大小而使成差別移動,將混合物內各物質分離。一般極性大的物質被吸附較多,而極性較小的物質因不易被吸附,因此較易向下流動。通常須先以溶劑潤濕此一管柱,再置入欲分離之混合物或將混合液先以適量溶劑製成稀泥(Slurries)再置入管柱,如果 製作稀泥所用的溶劑與沖提溶劑(移動相)不同,則須反覆以沖提溶劑沖洗溶解在吸附劑內的溶劑直至被清洗為止。如圖 8-6 為一般常用的管柱色層分析裝置。典型應用於 C.C 是分離樹葉中的色素,因樹葉中多含有葉綠素、葉黃素及葉紅素,三種色素具有不同的官能基(Functional group),因此可使用色層分析法予以分離。若沖提溶劑有拖尾(Tail)現象,須改變沖提溶劑,有時為達到完全分離混合物,亦須改變沖提溶劑。至於沖提溶劑的變換須以極性大小作參考(如圖 8-1 所示),但須注意其變更須依沖提極性順序逐漸改變,不可使溶劑極性作突然的改變。器材:玻片兩片、試管、燒杯、毛細管 4 支、Whatman#1 濾紙、錐形瓶、鋁箔紙、分液漏斗、色層分析管柱、過濾瓶及抽氣器等 藥品:TLC 板三片、矽膠、鄰-硝基苯胺、間-硝基苯胺、對-硝基苯胺、丙酮、樹葉、玻璃棉、砂、礬土、氯仿、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、甲基氯及矽膠等 實驗步驟:(一)薄層色層分析:1.在市售TLC板兩端是當距離分別畫上起使線即展開終點線,並分成五間隔 2.取三支試管分別加入小量鄰-硝基苯胺、間-硝基苯胺或對-硝基苯胺,再分別加入 2mL 乙酸乙酯,均勻混合,另取一支試管加入小量鄰-硝基苯胺、間-硝基苯胺或對-硝基苯胺,再加入 2mL 乙酸乙酯,均勻混合。使用毛細管吸取混合液、滴四點分別在三塊 TLC 板上的起始線 3.分別將三塊TLC板有滴點的一端適當地置於三種展開劑乙酸乙酯/正己烷,展開混合液之點 4.分別求出各成份的 Rf值 5.比較不同展開劑各成份之 Rf值(二)濾紙色層分析法:1.取一張色層分析用濾紙切成 16x2cm 規格 2.同時再切成的濾紙兩端約 1.5cm 處各劃一直線,是為起始線及展開終點線 3.在其中一條直線中心以毛細管滴點已萃取過的樹葉色素。同時以丙酮作展開劑 4.如圖 8-4 所示裝置,先將 20mL 丙酮加入錐形瓶內,再將已製備好的濾紙放入 5.以鋁箔蓋緊瓶口,開始展開作用 6.當展開劑到達展開終止線時,取出濾紙,使其乾燥 7.求出各點 Rf值(三)管柱色層分析:1.先將樹葉用己烷萃取出色素溶液,裝入一小燒瓶內 2.取一色層分析管柱在管底先鋪一層棉花其上再加 3mm 砂層 3.按照表 8-1 所示配製礬土的稀泥作為吸附劑 4.一邊將吸附劑加入管柱內,一邊用Suction吸引,待吸附劑填至距管柱上端1吋時為止 5.將 5 滴萃取液加入管柱中 6.當萃取液進入吸附劑後,在管柱上端裝一分液漏斗置入苯,在將苯小心地加入管內,如果有色素出現,即換另一錐形瓶收集 7.繼續以苯、甲基氯及乙酸乙酯等極性較強的溶劑加入沖提 8.記下每瓶內收集的色素顏色及次序