赖氨酸转基因大米与亲本大米在五指山小型猪回肠中的消化代谢比较.pdf

32?第 39卷?第 1期2010年?1月卫?生?研?究JOURNAL OF HYG I ENE RESEARCH?Vo.l 39?No.1Jan.?2010文章编号:1000?8020(2010)01?0032?04?论著?赖氨酸转基因大米与亲本大米在五指山小型猪回肠中的消化代谢比较胡贻椿?李敏?朴建华?杨晓光1中国疾病预防控制中心营养与食品安全所,北京?100050摘要:目的?对赖氨酸转基因大米与其亲本大米中蛋白质和氨基酸在猪回肠的消化代谢情况进行比较研究。方法?选择近交系五指山小型猪为实验动物,通过外科手术将 T型瘘管安置于小型猪回肠末端,给其饲喂赖氨酸转基因大米和亲本大米,收集小型猪回肠末端的消化产物进行分析,采用酪蛋白饲料法测定内源性氨基酸的排出量,从而比较两种大米蛋白质和氨基酸的表观消化率和真消化率。结果?赖氨酸转基因大米与亲本大米的蛋白质表观消化率和真消化率都没有显著差异;各种氨基酸的消化率结果显示,除半胱氨酸的表观消化率外,其他氨基酸的表观消化率和真消化率都没有显著差异。结论?赖氨酸转基因大米与亲本大米在五指山小型猪体内的蛋白质和氨基酸消化代谢基本没有差异,均能很好地被消化吸收。关键词:赖氨酸?转基因大米?五指山小型猪?表观消化率?真消化率中图分类号:TS201?6?Q591?2?R155?51?文献标识码:AComparative research on digestibility of lysine?rich geneticallymodified rice and its parental rice inW uzhishan m ini?pigHU Yichun,LIM in,PIAO Jianhua,YANG X iaoguangInstitute ofNutrition and Food safety,Chinese CDC,Beijing?100050,ChinaAbstract:Objective?To study the digestibility of protein and amino acids in lysine?rich genetically modified(GM)rice and its parental rice.M ethods?EightW uzhishanM ini?pig Inbred?line as the experi mental ani mals,T?cannulaswere equipped at their ter m inal ileums by surgicaloperation.Six of them,whichwerewell?healed andwithgood appetite,were fed with lysine?rich geneticallymodified rice and its parental rice,and digesta of each pig wascollected and analyzed respectively for comparing their apparentdigestibility(AD)and true digestibility(TD).Theendogenous amino acids losseswere deter m ined by casein dietmethod.Results?TheAD andTD of protein are verysi m ilar in the two types of rice.There are no statistical differences in the AD of allam ino acids except for Cysteine,and there are no statisticaldifferences in theTD of all18 amino acids.Conclusion?The lysine?richGM rice has nostatistical difference w ith its parental rice in ter ms of protein and amino acid digestion and absorption inW uzhishanm ini?pigs.K ey words:lysine,genetically modified rice,W uzhishanm ini?pig,apparent digestibility,true digestibility基金项 目:国家 重点 基础 研究 发展 计划 973!项目(No.2007CB109207);转 基 因生 物 新 品 种培 育 重 大 专项 课 题(No.2008ZX08011?005)作者简介:胡贻椿,女,博士研究生,研究方向:转基因产品安全性评价研究,E?mai:l huyichun0319 1通讯作者:杨晓光,男,研究员,博士生导师?随着人们生活水平的提高,食品营养问题越来越受到关注。水稻是世界三大粮食作物之一,世界上有将近二分之一的人口以水稻为主食,然而天然水稻品种缺乏赖氨酸和色氨酸 1,不能满足人们对全面营养的需求。利用转基因技术对水稻进行有针对性的 营养改良!,可以获得具有较全面的、高营养价值的品种,从而弥补天然水稻中的此类营养缺陷。然而,营养改良型的转基因大米由于其营养成分与传统亲本大米的成分不具备实质等同性 2,故在对其的评价中,必须评价外源基因在大米中表达的蛋白是否会影响到大米中蛋白质或氨基酸的消化吸收。本研究对一种赖氨酸转基因大米与其亲本大米中蛋白质和氨基酸的消化利用情况进行了比较,以期为该赖氨酸转基因大米的后续评价提供数据。1?材料与方法1?1?试验大米及饲料的配制赖氨酸转基因大米 HL5是将水稻谷蛋白 G t1基因与泰国四棱豆高赖氨酸含量蛋白基因(LRP)融合后导入传统粳稻品种 WT大米中,使目的基因在水稻种子中高效表达获得的。将大米样品磨碎,过 20目筛。添加 1%的大豆色拉油增加饲料的适口性和避免粉尘,添加 0?1%的维生素预混料和 0?8%矿物质预混料以满足猪生长的需求,按 0?3%的比例添加Cr2O3作为指示剂。第 1期胡贻椿,等.赖氨酸转基因大米与亲本大米在五指山小型猪回肠中的消化代谢比较33?酪蛋白饲料用于猪内源性氨基酸排出量的测定,含有5%酪蛋白、20%蔗糖、65?75%玉米淀粉、1?7%磷酸氢钙、0?35%的氯化钠、1%大豆色拉油、0?1%维生素预混料、0?8%矿物质预混料及 0?3%Cr2O3。所有饲料均为粉料,日粮按小型猪体重的 3%4%给予。1?2?试验动物本研究采用近交系五指山小型猪(WZSP),购自中国农业科学院畜牧研究所,许可证号为:SYXK(京)2008?0007。挑选健康成年去势公猪 8头,体重为 30 35kg,术前放入猪代谢笼中单笼饲养,适应喂养 7天,期间进行肠道驱虫处理。禁食36小时,禁水 12小时后在北京市 SPF猪育种中心进行回肠末端造瘘手术。1?3?手术方法及术后管理按霍启光等 3的方法并稍作改进实施造瘘手术。术前对猪进行全身麻醉后,右侧卧位固定于手术台上。在距回盲瓣约 6cm处的回肠上作一长约 4c m的切口,将 T型瘘管放入并绕瘘管进行缝合,然后将瘘管送回腹腔,在距原切口头侧3 4cm处另做一切口引出瘘管,用一侧封闭的螺母固定并标记方向以避免发生肠管扭转,最后缝合原切口。手术后的恢复期为 3周,前 1周每日给小型猪注射 5%恩诺沙星注射液消炎,用碘酒对缝合处和瘘管周围进行擦拭,保持伤口清洁以防感染。伤口开始长肉时于瘘管周围和缝合处喷贝复济以促进伤口愈合,术后 1周左右拆线。挑选术后瘘管处和缝合处恢复良好、进食正常的小型猪 6头进入正式试验。正式试验开始前的适应喂养和手术恢复期内饲喂的普通饲料营养水平均达到或超过 NRC4营养水平,猪于代谢笼内的自动饮水嘴自由饮水。1?4?试验方法采用 2 2拉丁方设计,每次每个处理设置 2个重复,分别给予 WT 大米饲料、HL5大米饲料,每天 8:00和 20:00各喂 1次。适应喂养 4天,记录每头猪的进食量,第 5 7天收集食糜。由于酪蛋白饲料是低蛋白饲料,为不影响猪的营养状况,在上述实验结束后再给每头小型猪饲喂酪蛋白饲料,测定每头小型猪的内源性氨基酸排出量(EAL),喂食时间和食糜的收集安排不变。收集期采用自制的导流管连接在 T型瘘管的末端收集食糜,收集时间为 8:00 20:00,收集 12小时。排出的食糜收集到密封袋中,每小时更换 密封袋并迅 速将食糜样 品置于-20#冰箱中冷冻保存。1?5?样品的处理和指标测定将所有食糜样品自然解冻,并把每头猪每期试验的食糜样品分别混合均匀后进行冷冻干燥,室温下回潮形成风干样品。将各样品粉碎过 60目筛,然后进行测定。大米饲料和食糜中的蛋白质根据 GB/T 5009?52003(第一 法)测定 5;氨 基酸 采用 GB/T 5009?1242003 测定 6;铬采用 GB/T 5009?1232003进行测定 7;水分采用GB/T 5009?3?2003(第一法)进行测定 8。1?6?结果计算及统计表观消化率(apparent digestibility,AD)、内源性氨基酸排出量(endogenous a m ino acid Loss,EAL)和 真消化率(truedigestibility,TD)分别按以下公式计算 9。差 异分析采用SAS 9?1中配对 t检验进行分析。(1)AD=100%-MfeedMdigestaNdigestaNfeed 100%(2)EAL(g/kg)=Nd igetaMfeedMdigeta(3)TD=AD+EALNfeed 100%?其中,Mfeed:饲料中铬的含量(mg/kg);Mdigesta:食糜中铬的含量(mg/kg);Nfeed:饲料中氮或氨基酸的含量(g/kg);Nd i gesta:食糜中氮或氨基酸的含量(g/kg)。2?结果2?1?赖氨酸大米与亲本大米中蛋白质和氨基酸含量比较由表 1可知,赖氨酸转基因 HL5大米与亲本 WT 大米的蛋白质及各种氨基酸在含量上有一定的差异,其中 HL5大米比 WT大米的赖氨酸含量提高了 3?17mg/g粗蛋白。表 1?赖氨酸大米 HL5与亲本大米 WT中氨基酸含量的比较Table 1?Co m parison of crude protein and am ino acids inlysine?rich GM rice and paren t al rice成分WT 大米(g/100g)HL5大米(g/100g)粗蛋白9?579?08苏氨酸0?310?28缬氨酸0?550?45蛋氨酸0?200?15异亮氨酸0?360?30亮氨酸0?850?65苯丙氨酸0?500?41赖氨酸0?300?31色氨酸0?080?08丝氨酸0?480?40天冬氨酸0?800?73谷氨酸1?751?34甘氨酸0?400?35丙氨酸0?520?40酪氨酸0?290?18组氨酸0?200?18精氨酸0?760?62脯氨酸0?400?32半胱氨酸0?210?18赖氨酸/粗蛋白(mg/g)30?9934?16?2?2?赖氨酸大米与亲本大米表观消化率的比较由表 2可知,HL5大米与 WT大米的蛋白质表观消化率无显著差异(P=0?936),除甘氨酸和脯氨酸的消化率小于60%外,其他氨基酸的表观消化率基本介于 77%94%之间。将 HL5大米与 WT大米的各种氨基酸分别进行差异性检验,结果表明除了半胱氨酸外,小型猪对各氨基酸的表观消化率均无显著差异。2?3?赖氨酸大米与亲本大米真消化率的比较由于表观消化率没有考虑内源性氨基酸的排出,因此会低估蛋白质的消化程度。真消化率在表观消化率的基础上加上了内源性氨基酸的排出,故可以较为准确地评价蛋白质和氨基酸的真实消化代谢情况。34?卫?生?研?究第 39卷表 2?赖氨酸大米与亲本大米表观消化率比较Table 2?Apparent digestibility of lysine?richGM rice and parental rice成分WT 大米表观消化率(%)HL5大米表观消化率(%)P粗蛋白78?43%2?8678?25%5?270?936苏氨酸79?58%2?4877?10%2?870?194缬氨酸87?19%1?9385?65%1?850?259蛋氨酸85?73%5?6085?53%0?940?934异亮氨酸86?15%2?1284?76%2?530?324亮氨酸88?77%1?9487?18%1?990?286苯丙氨酸89?00%1?6488?30%1?230?495赖氨酸79?67%2?5079?31%2?820?850色氨酸82?67%2?0880?36%1?910?213丝氨酸85?32%1?9283?79%1?570?317天冬氨酸86?21%2?1483?41%2?260?116谷氨酸88?42%2?3088?03%1?160?782甘氨酸59?85%9?5159?44%6?040?084丙氨酸82?52%1?6179?46%3?530?181酪氨酸85?82%3?7382?11%4?250?275组氨酸84?75%2?0683?19%1?990?354精氨酸90?49%2?5287?87%4?530?163脯氨酸58?73%8?6857?39%6?670?520半胱氨酸94?67%0?6492?70%0?990?020?采用酪蛋白饲料法对小型猪的内源性氨基酸排出量进行测定,结果如表 3所示。将内源性氨基酸排出量代入公式(3)中,获得两种大米的真消化率如表 4所示。表 3?五指山小型猪内源性氨基酸排出量Table 3?Endogenous am ino acids loss ofWuzhishan m ini?pigs氨基酸食糜中氨基酸的含量(g/100g)内源性氨基酸排出量(g/kg)粗蛋白14?10%0?9917?66%2?39天冬氨酸0?93%0?101?17%0?17苏氨酸0?54%0?080?68%0?10丝氨酸0?52%0?080?65%0?10谷氨酸1?03%0?141?28%0?19甘氨酸1?36%0?231?70%0?30丙氨酸0?64%0?120?80%0?15缬氨酸0?54%0?080?67%0?10蛋氨酸0?09%0?010?11%0?02异亮氨酸0?38%0?070?48%0?09亮氨酸0?70%0?120?87%0?15酪氨酸0?18%0?030?22%0?03苯丙氨酸0?37%0?060?47%0?08赖氨酸0?60%0?120?74%0?15组氨酸0?20%0?020?25%0?03精氨酸0?46%0?040?58%0?07脯氨酸2?73%1?053?49%1?51色氨酸0?12%0?020?15%0?02半胱氨酸0?12%0?020?15%0?03?由表 4可知,HL5大米与 WT大米的蛋白质真消化率没有差异,小型猪对氨基酸的真消化率都高达 90%以上。将两种大米的氨基酸真消化率进行差异性检验,结果表明,各种氨基酸的真消化率均无显著差异,两种大米的蛋白质和氨基酸都可以很好地被小型猪消化吸收。表 4?赖氨酸大米与亲本大米真消化率比较Table 4?True digestibility of lysine?rich GM rice and parental rice成分WT大米真消化率(%)HL5大米真消化率(%)P粗蛋白96?42%2?1896?24%3?710?936苏氨酸101?17%4?4899?06%3?040?254缬氨酸99?74%2?9997?82%1?740?177蛋氨酸92?81%5?9291?25%1?160?541异亮氨酸98?43%3?6198?00%2?920?738亮氨酸97?66%2?8197?38%1?670?836苯丙氨酸99?26%3?0697?70%1?710?175赖氨酸103?08%6?04104?36%5?030?493色氨酸108?51%3?6199?15%3?610?087丝氨酸99?86%3?3798?30%2?260?311天冬氨酸99?91%3?8596?94%2?670?101谷氨酸95?56%2?9295?37%1?300?897甘氨酸101?18%7?8393?58%9?670?114丙氨酸98?11%3?1194?92%4?140?165酪氨酸95?06%3?5592?73%2?090?159组氨酸98?11%3?1795?57%2?670?159精氨酸99?43%2?2595?43%4?470?054脯氨酸100?34%12?47100?85%8?890?826半胱氨酸101?92%0?6799?70%1?420?060?3?讨论猪在营养消化代谢方面与人类相似,其中近交系 WZSP解剖学、生理学特征及疾病发生机制等与人类极其相似,可用于异种移植、心血管疾病、营养代谢等多方面的研究。此外,近交系的 W ZSP由于高度近交基因纯合,其个体之间差异较小,是理想的实验动物模型 10。韩军花等曾用普通猪作为试验动物对抗虫的转 SCK 基因大米进行了蛋白质及氨基酸的消化率研究 9。本研究在其基础之上,采用个体小、生理学特征与人类更为相似的WZSP,对营养改良型的赖氨酸转基因大米进行了蛋白质和氨基酸的消化代谢情况研究。本研究中实施了回肠末端造瘘手术的 8头小型猪,除了 2头由于瘘管脱落而未进入正式试验外,其他 6头创口愈合良好的小型猪在整个试验过程中的进食、饮水及体况都保持了良好的状态,故认为在整个实验过程中小型猪是处于正常的生理状态之下。本研究采用回肠末端造瘘法收集小型猪小肠末端消化代谢产物,这种方法能直观地反映受试物在小肠内的消化情况。传统的粪便收集法由于食物要经过大肠,大肠中的微生物会对未消化完全的产物继续发酵,从而会影响蛋白质和氨基酸的排出量,不能真实反映出受试物在体内的消化情况。Cr2O3作为指示剂被添加到试验大米中,其口感容易被动物接受、不会被动物消化吸收、回收率高,且简单方便、易于操作。采用酪蛋白饲料法测定内源性氨基酸的排出量,酪蛋白饲料从理论上是可以完全吸收的,且对消化道内源性氨基第 1期胡贻椿,等.赖氨酸转基因大米与亲本大米在五指山小型猪回肠中的消化代谢比较35?酸分泌的刺激作用明显,能更真实地反映机体内源性氨基酸的排出情况 11?13。本研究结果显示,HL5大米和 WT 大米的蛋白质表观消化率没有显著差异,两种大米各种氨基酸的表观消化率结果显示除了半胱氨酸之外,其他氨基酸的表观消化率均无显著差异;HL5大米与 WT大米的蛋白质和各种氨基酸的真消化率均无显著差异。由此可见,HL5大米和 WT 大米的蛋白质和氨基酸在五指山小型猪体内消化代谢没有显著差异,均能很好地被小型猪消化吸收。(致谢:感谢万宝璠先生在试验过程中给予的大力帮助)参考文献1?钱映雪.种子蛋白品质改良的发展和展望 J.中国种业,2001,(4):13?14.2?FLACHOW SKY G,CHESSON A,AULR I CH K.Ani mal nutritionw ith feeds from genetica lly modified plants J.A rch Ani m Nutr,2005,59(1):1?40.3?霍启光.饲料生物学评定技术 M.北京:中国农业科技出版社,1996:120?126.4?National Research Counci.lNutrient Requirements of Sw ine M.10th ed.W ashington DC:NationalA cademy Press,1998.5?中华人民共和国卫生部.GB/T 5009.52003 食品中蛋白质的测定 S.北京:中国标准出版社,2003.6?中华人民共和国卫生部.GB/T 5009.124 2003食品中氨基酸的测定 S.北京:中国标准出版社,2003.7?中华人民共和国卫生部.GB/T 5009.123 2003食品中铬的测定 S.北京:中国标准出版社2003.8?中华人民共和国卫生部.GB/T 5009.3 2003食品中水分的测定 S.北京:中国标准出版社,2003.9?韩军花,杨月欣,门建华,等.转基因大米与亲本大米猪回肠蛋白质及氨基酸消化率的比较研究 J.营养学报,2004,26(5):362?364.10?张青峰,冯书堂.小型猪品系五指山猪(WZSP)的研究进展 J.安徽农学通报,2007,13(14):161?162.11?DE LANGE C F M,SAUER W C,MOSENTHI N R.The effect ofprotein status of the pig on the recovery and am ino acid composition ofendogenous protein in digesta collected from the distal ileu m J.JAniSc,i 1989,67:746?754.12?MOUGHAN P J,RUTHERFURD S M.Endogenous flow of totallysine and other amino acids at the distal ileurn of the protein?orpeptide?fed rat:thechem ica l labellingof gelatinproteinbytransfor mation of lysine to homoarg inine J.J Sci Food Agr,i 1990,52(2):179?192.13?张永成,李德发,邢建军,等.酪蛋白和无氮日粮对猪回肠内源氨基酸排出量的影响 J.中国畜牧杂志,2001,37(4):16?18.收稿日期:2009?06?20(上接第 31页)含量增高有关,因为脂肪酸可轻度上调 PPAR?的表达 6。粗杂粮组大鼠的 HOMA?IR显著低于其他 3组,而 PPAR?的表达要高于其他组,表明粗杂粮能改善大鼠的胰岛素抵抗,并且提示粗杂粮改善胰岛素抵抗的机制之一可能是通过上调PPAR?的表达来实现的。近年来研究发现 PPAR可直接加强脂肪细胞胰岛素受体后的信号转导过程,从而增强脂肪细胞对胰岛素的敏感性 7。粗杂粮使发生胰岛素抵抗大鼠的体重下降,改善了大鼠的肥胖程度。而肥胖与胰岛素抵抗是密切相关的,是代谢综合征、2型糖尿病、心血管疾病、癌症等疾病的强危险因素,脂肪组织分泌的细胞因子例如 TNF?、IL?1等更是在胰岛素抵抗的发生发展过程中扮演了重要角色。PPAR?活化后能够调节脂肪组织中细胞因子的生成,包括 TNF?、IFN?、IL?1、IL?2、TGF?等,从而抑制脂肪生成,改善胰岛素抵抗 8?9。目前对预防和治疗胰岛素抵抗的研究多集中在降压药、降血脂药、中成药等药物治疗方面10?12,尚未发现粗杂粮食品对胰岛素抵抗改善作用的报道。本文发现,复配式粗杂粮食品具有良好的改善胰岛素抵抗的作用,为预防和治疗胰岛素抵抗提供了经济方便的饮食治疗的物质基础。参考文献1?郭宝福,翟成凯,陈晗,等.复配式粗杂粮的营养成分特征及其对人体血糖生成的影响 J.卫生研究,2006,35(3):365?367.2?陈晗,翟成凯,陈学芬,等.复配式粗杂粮改善脂代谢紊乱作用的实验研究 J.卫生研究,2007,36(3):314?316.3?曹佩,翟成凯,张红,等.大豆蛋白对脂代谢紊乱大鼠脂代谢及炎症因子作用的研究 J.食品科技,2008,33(12):183?185.4?范建高,丁晓东,王国良,等.高脂饮食性非酒精性脂肪性肝病大鼠肝脏 PPAR?表达增强 J.肝脏,2004,9(4):225?228.5?OKUMURA T,KOHGO Y.Increased expression of PPAR gamma infatty liver induced by high fat diet J.N ippon R insho,2006,64(6):1056?1061.6?LOFI US T M,LANE M D.Modulating the transcriptional contro l of adipogenesis J.CurrOpin Genet Dev,1997,7(5):603?608.7?EDVARDSSON U,BERGSTROM M,ALEXANDERSSON M,et a.lRosiglitazone(BRL49653),a PPAR gamma?selective 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