1、实验五 水中细菌总数的检测
一、 实验目的
1. 采用标准平皿法对水样中细菌作计数。
2. 掌握微生物实验中无菌操作技术方法。
二、 实验原理
水中细菌总数往往同水体受有机物污染的程度呈正相关，它是评价水质污染程度的一个重要指标之一。由于重金属及某些其他有毒物质对细菌有杀灭或抑制作用，因此总细菌数少的水样，并不能排除已被这些物质所污染。
试验采用标准平皿法对水样中细菌作计数，这是一种测定水中好氧的和兼性厌氧的异养细菌密度的方法，由于细菌在水体中能以单独个体、成对、链状，成簇或成团的形式存在，此外没有单独的一种培养基或某一环境条件能满足一个水样中所有细菌的生理要求，
2、所以由此法所得的菌落数实际上要低于被测水样中真正存在的活细菌的数目。细菌总数是指l ml水样在营养琼脂培养基中，37ºC、24h培养后所生长的菌落数。一般规定，1ml自来水中总菌数不得超过100个。
三、材料和器皿
1.培养基：营养琼脂培养基
牛肉膏：3-5 g ； NaCl ：5 g ； 蛋白胨：10 g ； 琼脂：15-20 g；
H2O ：1000 ml ； pH ：7.0-7.2.
2.无菌采样瓶、灭菌移液管、灭菌培养皿，盛有90ml及9ml灭菌蒸馏水的锥形瓶和试管。
四、方法和步骤
1.采集水样。
2.吸取10ml水样(
3、河水、污水、游泳池水或港湾水等)，注入罐有90ml无菌水的三角瓶中，混匀成10-1稀释液，在吸水样前，水样应彻底搅动均匀。
3.按10倍稀释法将水样稀释成10-2、10-3、l0-4。
4.营养琼脂培养基(用于河水样)倒平皿(厚度约2-3毫米，12毫升）水平放置至固化。
5.根据水样的洁净程度，污染严重者选取10-2、10-3、l0-4稀释度；中等的选取10-1 、10-2、10-3稀释度，每个稀释液分别注入两个培养皿，每皿0.2 ml，用玻璃刮刀涂匀。稀释度的选择是本试验精确度的关键，选择适宜者，平皿上菌落总数介于30～300个之间。
6.将培养皿倒置于37ºC 培养
4、24h，可观察出明显菌落。
五、结果与分析
取同一稀释度的平板培养物，依菌落计算原则进行计算。
1.菌落计算原则
平皿菌落的计算，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，防止遗漏，也可借助于菌落计数器计数。对长得相当接近，但不相触的菌落，应予以一一计数。对链状菌落，应当作为一个菌落来计算。平皿中若有较大片状菌落时则不宜采用，若片状菌落少于平皿的一半时，而另一半中菌落分布又均匀，则可将其菌落数的2倍作为全皿的数目。算出同一稀释度的平均菌落数，供下一步计算时用。
2. 计算方法
2-1.首先选择平均菌落数在30~300个进行计算。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即可用它作为平
5、均值乘其稀释倍数(见表1的例4)。
2-2.若有两个稀释度的平均菌落数都在30~300之间，则应按两者的比值来决定。若其比例小于2，应报告两者的平均数，若大于2，则报告其中较小的数字(见表1的例2和例3)。
2-3.如果所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1的例4)。
2-4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1的例5)。
2-5.如果全部稀释度的平均菌落数均不在30~300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1的例6)。
2-6.菌落计数的报告，菌落
6、在100以内时，按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示(见表1的“报告方式”栏)。
六、思考题
1、本实验为什么要选择适当的稀释度？
2、在本实验操作中应该注意什么问题？
附：
表1 稀释度选择及菌落报告方式
例次
不同稀释度的平均菌落数
两个稀释度菌落数之比
菌落总数
(个/ml）
报告方式
(个/ml）
10-1
10-2
10-3
1
1360
164
20
-
16400
16000或1.6x104
2
2760
295
46
1.6
37750
38000或3.8x104
3
2890
271
60
2.2
27100
27000或7x104
4
无法计数
4651
513
-
513000
510000或5.1x105
5
27
11
5
-
270
270或2.7x102
6
无法计数
305
12
-
30500
31000或3.1x104
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