青光眼的动物模型.pdf

综述青光眼的动物模型刘红 詹桂林 徐亮【摘要】青光眼的动物模型分为两大类:一类为高眼压模型,另一类为非高眼压视神经损伤模型。从建立动物模型的方法看,每种方法均有其理论基础,每一种动物模型均能模拟某一类型青光眼或青光眼的某一方面的病理改变;从选择的动物品种看,不同品种的动物各有优缺点。应根据不同的试验设计,采用合理的青光眼模型,以期得到科学的观察数据并作出科学的结论。【关键词】青光眼;动物模型 作者单位:68198美国内布拉斯加大学医学中心眼科(刘红,詹桂林);四川省人民医院眼科(刘红);首都医科大学附属北京同仁医院眼科中心 北京市眼科研究所(徐亮)通讯作者:詹桂林,Email:gzhan unmc.edu 青光眼在世界上不可逆的致盲眼病中居第二位。目前青光眼的发病机制、视神经损害及保护机制尚不完全清楚,因此较好地模拟人类青光眼的动物模型对其研究显得十分必要。普遍认为青光眼的主要危险因素是高眼压,然而高眼压不是唯一的因素,其他因素如视神经缺血,视网膜神经节细胞(retina ganglion cell,RGC)的内在敏感性在正常眼压性青光眼患者起关键性作用;高眼压或其他因素的最终结果是视网膜神经节细胞死亡,视神经发生进行性损害,从而导致不可逆性视力丧失1。因此青光眼动物模型有两大类:一类为高眼压模型,另一类为非高眼压的视神经损伤模型。一、高眼压青光眼动物模型(一)急性高眼压动物模型将生理盐水灌注入前房,在45min至1h中眼压急剧增高至70120mmHg。骤然升高的眼压导致视网膜中央动脉、眼动脉的血供短暂中断,引起RGC死亡。该模型产生的病理特征几乎与临床急性闭角型青光眼类同,此模型能代表急性闭角型青光眼,用于急性高眼压的生理和病理研究2。(二)慢性高眼压动物模型目前慢性高眼压动物模型广泛应用于青光眼研究中。慢性高眼压动物模型的制备方式归纳起来主要有5种。1.巩膜上静脉高渗盐水注射法Morrison等3将高渗盐水注入Brown Norway大鼠巩膜上静脉,导致小梁网硬化,前房角前粘连,而Schlemm管、收集管及房水静脉均正常。小梁网的硬化导致持续性眼压升高,从而引起视神经损害。此模型与人类开角型青光眼的发病机制有较多的相似性。在该模型中用Brown Norway大鼠的优点是可不用全麻,在大鼠清醒状态下测眼压。在清醒状态下测眼压可使眼压记录更为准确、可靠,同时避免了全麻状态下测眼压的缺点,全麻可导致眼压降低和眼压变化,掩盖24h眼压昼夜节律的变化4。此模型的缺点是操作较复杂,需要注射高渗盐水的特殊精细管,且需重复注射,只有60%的眼眼压升高5。2.激光光凝小梁网法早在1974年,Gaasterland等6应用激光光凝猕猴小梁网建立了慢性高眼压模型,该模型病理改变部位局限于小梁网并造成周边虹膜前粘连,其阻塞房水外流部位接近Schlemm管,比较符合开角型青光眼的病理改变。该模型的特征是激光光凝后,眼压短暂、急剧下降,房水流量减少。其眼压降低、房水流量减少可能是炎性反应,睫状突受损所致7,组织病理学证实激光损伤了周边虹膜、巩膜突和后部小梁网。激光光凝猴小梁网建立的慢性高眼压模型已被许多实验室采用。虽然灵长类青光眼模型是最接近人类的模型,但由于不易取材、成本昂贵,特别在某些试验如研究RGC损伤机制,需要较大样本量方面具有一定的局限性。因此有学者用激光光凝大鼠的小梁网建立慢性高眼压的大鼠模型8,日本学者Ueda等9用印度蓝注入前房,碳离子堆积在前房角形成一黑色条带,不需要前房角镜,以黑色条带为标记激光光凝小梁网,眼压升高维持了4周,组织301国际眼科纵览2007年4月第31卷第2期 Int Rev Ophthalmol,April 2007,Vol 31,No.2学切片也证实形成了周边虹膜前粘连。激光光凝小梁网法的缺点是需多次激光光凝才能达到60%的成功率5。3.巩膜上静脉烧灼法Shareef等10将Wistar大鼠两条以上的巩膜上静脉烧灼,增加了小梁网后的阻力,能产生高于正常眼压两倍以上的眼压,且能维持较长时间,眼压升高的机制可能是由于葡萄膜脉管系统充血所致11。此模型较好地模拟了人类继发性青光眼部分特征,还具有操作简便,成功率较高的特点。近来有学者提出烧灼巩膜上静脉虽然阻塞了房水外流,也造成了眼内充血,因此,眼内充血对眼组织的影响程度还需进一步研究证实5。4.激光光凝巩膜上静脉法由于小鼠眼小、巩膜薄,特别适合用激光光凝巩膜上静脉法制作高眼压模型。小鼠应用其它方法制作高眼压模型均不可行。WorldeMussie等8用激光光凝大鼠角膜缘的静脉及距角膜缘015至018 mm的巩膜上静脉,眼压升高了两倍,并且维持了2个月。但Levkovitch2Verbin等12报道激光光凝巩膜上静脉诱导的高眼压不如激光光凝小梁网升高眼压效果明显,且高眼压维持时间不长。激光光凝巩膜上静脉产生的高眼压模型的原理与巩膜上静脉烧灼法类同,巩膜上静脉烧灼法需烧灼2至3 mm的巩膜上静脉,烧灼范围较大;激光光凝巩膜上静脉可光凝1 mm以内的巩膜上静脉,光凝范围较小,使得激光光凝巩膜上静脉可应用于小鼠。小鼠较其它动物的最大优点是易于进行遗传操作,易于研究青光眼视神经损害的分子机制。小鼠眼前节许多解剖结构与人眼相似,如有发育很好的小梁结构、Schlemm管、睫状体和视网膜脉管系统、小鼠的巩膜葡萄膜通路与人眼相同、小鼠有无髓鞘的神经纤维层,且小鼠的眼压调节与人眼类似12。非侵入性眼压计的应用及测量小鼠房水动力学的可行性,使开发小鼠高眼压模型显得更为重要。相比较基因突变型小鼠高眼压模型,野生型小鼠高眼压模型能更有利于青光眼的机制及治疗的研究,因为基因突变型小鼠高眼压模型是由于眼前节的异常导致高眼压,这种发育变化对青光眼损伤机制的影响目前不清楚1。5.前房注入外来物质Mermoud等13在兔前房内注入S2抗原,诱发葡萄膜炎建立兔高眼压模型。注入S2抗原第2至5天,眼压降低,第6至20天,眼压升高,此模型有较严重的炎性反应,有学者用乳汁微粒或透明质酸钠注入前房,炎性反应大大减少,可观察眼底。Weber和Zelenak14报道少量、缓慢、重复注射乳汁微粒可以诱发慢性高眼压。眼压升高可能是由于微粒直接堵塞了房水流出通道,但不能排除微粒导致了小梁网水肿,炎性细胞渗入房水流出通道。Moreno等15用透明质酸钠注入前房,每周一次,重复注射,维持高眼压,在3、6、10周均能见到视网膜电图改变,10周的组织学切片可见RGC细胞和视神经轴突减少。徐等16用复方卡波姆注射兔前房,高眼压持续时间较甲基纤维素和地塞米松注射组更长。(三)自发性高眼压模型自发性高眼压模型主要有三个纯系小鼠:DBA2NNia,DBA2J和AKXD228Ty。Sheldon等17报道通过严格食物喂养的DBA2NNia纯系小鼠模型,其前房角有新生血管出现,且周边前粘连,眼压升高。在DBA2J纯系小鼠模型,John等18发现小鼠虹膜萎缩,色素播散,眼压升高,RGC细胞死亡,视神经萎缩,青光眼视杯形成,形成了进行性继发性闭角型模型,类似于人的色素播散综合征和角膜虹膜内皮综合征。AKXD228Ty纯系小鼠模型是一新型模型,AKXD228Ty的遗传物质中含有的修正子抑制了色素播散,增加了眼压耐受的敏感性。DBA2J与AKXD228Ty两个纯系小鼠模型的主要不同点在于AKXD228Ty无色素播散,只有虹膜基质的萎缩,并且AKXD228Ty的RGC和视神经对高眼压更敏感19。近年来DBA2J纯系小鼠模型在研究青光眼的分子病理机制方面得到广泛应用,并且由于转基因技术发展,应用转基因和突变基因小鼠模型来研究眼压调节和青光眼视神经受损的分子学机制又成为模型研究的新热点。二、非高眼压视神经损伤模型青光眼的主要特征是视网膜RGC死亡,视神经进行性损害。在临床的许多病例中,虽然眼压得到了很好的控制,但是视神经仍继续进行性损害;而另一类正常眼压性青光眼,眼压正常,视神经也发生进行性损害,因此青光眼治疗的重点应在于对视神经的保护,有效地阻止或延缓RGC死亡。除了高眼压视神经损伤动物模型外,非高眼压视神经损伤动物模型对研究RGC死亡的发生机制、视神经的保护机制及筛选视神经保护的药物也是必不可少的。这类401国际眼科纵览2007年4月第31卷第2期 Int Rev Ophthalmol,April 2007,Vol 31,No.2视神经损伤模型主要分为以下三类。(一)视网膜缺血再灌注模型在正常眼压性青光眼中,RGC进行性减少可能是由于视网膜血流的改变,视网膜缺血所致,视网膜缺血再灌注模型主要用于研究青光眼患者血流量的减少对视神经、RGC死亡的影响。视网膜缺血模型分为急性视网膜缺血模型和慢性视网膜缺血模型。在急性视网膜缺血模型中,Bchi等20在大鼠前房内注入生理盐水,眼压升高至110mmHg,眼压超过大鼠的收缩血压可导致视网膜中央动脉的血供短暂中断,视网膜低灌注,高眼压维持90120min,可以导致RGC死亡,视神经萎缩;多位学者用此模型研究了视神经保护的药物,但此模型不能区分是高眼压还是视网膜缺血导致RGC的减少。另一种急性视网膜缺血再灌注模型不涉及眼压,分离出视神经,结扎眼血管导致视网膜缺血,发现视网膜的内核层细胞和RGC减少21。Vidal2Sanz等22用渗透性微型真空泵将血管收缩剂内皮素21以持续低流量,维持3天注入兔前部视神经周围的蛛网膜下腔,导致前部视神经周围的微血管收缩,产生慢性视神经缺血模型。Cioffi等23用此法建立了猴的慢性视神经缺血模型,猴前部视神经周围的微血管收缩导致了视神经轴突的减少,眼压没有变化。上述三种方法操作较复杂,有学者用血管收缩剂提出了更简单易行的方法,将内皮素21直接注入兔的玻璃体腔,观察到能引起视乳头和视网膜的慢性低灌注,视神经轴突减少24,或将内皮素21行结膜下注射25,通过荧光素眼底血管造影证实可以短暂中断视网膜中央动脉的血供,导致视网膜缺血再灌注。用血管收缩剂建立视网膜缺血再灌注的动物模型,在视神经的保护研究中被广泛应用。(二)机械损伤模型有部分青光眼患者,虽然眼压得到很好控制,但视神经仍继续损害。这部分青光眼患者,除了高眼压是原发因素外,还有其他因素。其他因素可能是原发因素导致的结果,例如原发性因素导致的神经元损害产生的中间产物,使得躲过了原发损害的视神经元产生继发性损害。因此在寻找视神经保护的药物时,可以在原发性损害与继发性损害之间着手,减弱不利因素或给细胞提供有利因素来应付原发性损害造成的变化。基于此理论,Yoles和Sch2wartz26用大鼠建立了一损伤挤压模型,在大鼠的视神经造成一可评估的局部神经退变病灶,该模型的原发性神经元损伤容易控制而继发性损害能够被量化,即使原发性损害去除,仍可刺激视神经的继发性损害,因此可用于观察视神经保护的治疗是否能终止视神经的进行性损害,筛选视神经保护的药物。此模型被广泛用作研究被损害的RGC的变性病理过程及筛选视神经保护的药物。(三)RGC兴奋性毒性损伤模型青光眼视力的丧失是由于选择性的RGC死亡,RGC的死亡又分为原发性和继发性损害两个阶段,原发诱因导致损害后,产生一有害的细胞环境导致继发性损害,谷氨酸在继发性损害中起重要作用26,在人和猴的青光眼玻璃体中发现谷氨酸增高27,进一步证明谷氨酸与青光眼RGC的损害有关。谷氨酸是中枢神经系统的主要兴奋性神经递质,当其浓度超过生理浓度,它即变成一种细胞毒素,高浓度的谷氨酸能刺激数种细胞受体,包括N2甲基天冬氨酸(N2methyl2d2aspartate,NMDA)受体。受体受刺激后,导致大量的钙离子进入细胞内,异常高的钙离子浓度导致异常的核酸酶、蛋白酶、脂肪酶激活,产生了自由基的释放和激活了一氧化氮通路,中间化合物和自由基的相互作用导致了细胞凋亡。RGC细胞对谷氨酸的毒性作用异常敏感,有学者用谷氨酸或其他兴奋性毒性化合物诱导动物RGC死亡,建立视神经损伤模型,Vorwerk等28建立了一慢性低剂量谷氨酸RGC中毒模型,将215mmolL,1l的谷氨酸每5天注射一次,注入大鼠玻璃体腔,大鼠玻璃体腔内源性谷氨酸浓度由5m至12m升高到26m至34m,大鼠玻璃体腔维持高浓度谷氨酸达3个月,3个月后发现RGC减少了42%;其他兴奋性毒性化合物如NMDA注入动物玻璃体腔导致RGC减少,但NMDA不仅能导致RGC细胞而且能导致在RGC细胞层的无长突细胞明显变性和减少29。三、小结青光眼动物模型增强了对青光眼生物基础的理解,使人们进一步了解了青光眼的病因、病理和分子生物学的改变,更重要的是能用动物模型对治疗青光眼的有发展前景的降眼压药物和视神经保护药物进行筛选和试验,为人类的临床试验提供依据。不同的青光眼模型均有各自的优、缺点,从建立动物模型的方法看,每种方法均有其理论基础,均能模拟某一种类型的青光眼或青光眼的某一方面;从选择的501国际眼科纵览2007年4月第31卷第2期 Int Rev Ophthalmol,April 2007,Vol 31,No.2动物品种看,大鼠的大小比较合适,但不如灵长类与人类相似;小鼠与大鼠模型有相似性,小鼠眼小,操作难度大,由于小鼠眼压的测量及房水动力学的可行性,小鼠具有其它动物没有的优点,如小鼠的突变株及转基因品系能够模拟青光眼的某些特殊方面的病理改变;灵长类与人类最接近,但灵长类价格昂贵。因此必须根据不同的试验设计,采用合理的青光眼模型,以期得到科学的观察数据并作出科学的结论。参考文献1Gross RL,Ji J,Chang P,et al.A mouse model of elevated intraoc2ular pressure:retina and optic nerve findings.Trans Am OphthalmolSoc,2003,101:163217112Ben Simon G J,Bakalash S,Aloni E,et al.A rat model for acuterise in intraocular pressure:immune modulation as a therapeuticstrategy.Am J Ophthalmol,2006,141:110521111.3Morrison JC,Moore CG,Deppmeier LM,et al.A rat model ofchronic pressure2induced optic nerve damage.Exp Eye Res,1997,648529614Jia L,Cepurna WO,Johnson EC,et al.Effect of general anesthet2ics on IOP in rats with experimental aqueous outflow obstruction.Invest Ophthalmol Vis Sci,2000;41:34152341915McKinnon SJ,Pease ME,WoldeMussie E,et al.Comparison ofthree models of rat glaucoma caused by chronic intraocular pressureelevation.Invest Ophthalmol Vis Sci,1999,40(4):S787.6Gaasterland D,Kupfer C.Experimental glaucoma in the rhesusmonkey.Invest Ophthalmol,1974,13:455245717Toris CB,Zhan GL,Wang YL,et al.Aqueous humor dynamics inmonkeys with laser2induced glaucoma.J Ocul Pharmacol Ther,2000,16:1922718WoldeMussie E,Ruiz G,Wijono M,et al.Neuroprotection of reti2nal ganglion cells by brimonidine in rats with laser2induced chronicocular hypertension.Invest Ophthalmol Vis Sci,2001,42:28492285519Ueda J,Sawaguchi S,Hanyu T,et al.Experimental glaucoma mod2el in the rat induced by laser trabecular photocoagulation after an int2racameral injection of India ink.Jpn J Ophthalmol,1998,42:3372344110Shareef SR,Garcia2Valenzuela E,Salierno A,et al.Chronic ocu2lar hypertension following episcleral venous occlusion in rats.ExpEye Res,1995,61:3792382111Morrison JC,Johnson EC,Cepurna W,et al.Understandingmechanisms of pressure2induced optic nerve damage.Prog RetinEye Res,2005,24:2172240112Levkovitch2Verbin H,Quigley HA,Martin KR,et al.Translim2bal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model ofglaucoma in rats.Invest Ophthalmol Vis Sci,2002,43:4022410.13Mermoud A,Baerveldt G,Mickler DS,et al.Animal model foruveitic glaucoma.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,1994,232:5532560114Weber AJ,Zelenak D.Experimental glaucoma in the primate in2duced by latex microspheres.J Neurosci Methods,2001,111:39248115Moreno MC,Marcos HJ,Oscar Croxatto J,et al.A new experi2mental model of glaucoma in rats through intracameral injections ofhyaluronic acid.Exp Eye Res,2005,81:71280116 徐岩,陈祖基,宋洁贞.复方卡波姆诱发的兔高眼压模型与其它兔高眼压模型的比较研究.中华眼科杂志,2002,38:1722175.17Sheldon WG,Warbritton AR,Bucci TJ,et al.Glaucoma in food2restricted and ad libitum2fed DBA2NNia mice.Lab Anim Sci,1995,45:5082518118John SWM,Smith RS,Savinora OV,et al.Essential iris atrophy,pigment dispersion,and glaucoma in DBAJ mice.Invest Ophthal2mol Vis Sci,1998,39:9512962,1641.19Anderson MG,Smith RS,Savinova OV,et al.Genetic modifica2tion of glaucoma associated phenotypes between AKXD228Ty andDBA2J mice.BMC Genet,2001,2:1213.20Bchi ER,Suivaizdis I,Fu J.Pressure2induced retinal ischemia inrats:an experimental model for quantitative study.Ophthalmolog2ica,1991,203:1382147121Melena J,Safa R,Graham M.The monocarboxylate transport in2hibitor,alpha2cyano242hydroxycinnamate,has no effect on retinalischemia.Brain Res,2003,989:1282134.22Vidal2Sanz M,Lafuente MP,Mayor S,et al.Retinal ganglion celldeath induced by retinal ischemia.Neuroprotective effects of twoalpha22 agonists.Surv Ophthalmol,2001,45(Suppl 3):S2612267123Cioffi GA,Wang L,Fortune B.Chronic ischemia induces regionalaxonal damage in experimental primate optic neuropathy.ArchOphthalmol,2004,122:151721525124Sasaoka M,Taniguchi T,Shimazawa M,et al.Intravitreal injec2tion of endothelin21 caused optic nerve damage following to ocularhypoperfusion in rabbits.Exp Eye Res,2006,83:6292637125Masuzawa K,Jesmin S,Maeda S.A model of retinal ischemia2reperfusion injury in rats by subconjunctival injection of endothelin211Exp Biol Med(Maywood),2006,231:108521089126Yoles E,Schwartz M.Degeneration of spared axonsfollowing par2tial white matter lesion:implications for optic nerve neuropathies.Exp Neurol,1998,153:127127Dreyer EB,Zurakowski D,Schumer RA,et al.Elevated gluta2mate levels in the vitreous body of humans and monkeys with glau2coma.Arch Ophthalmol,1996,114:2992305128Vorwerk CK,Lipton SA,Zurakowski D,et al.Chronic low2dose601国际眼科纵览2007年4月第31卷第2期 Int Rev Ophthalmol,April 2007,Vol 31,No.2glutamate is toxic to retinal ganglion cells.Toxicity blocked by me2mantine.Invest Ophthalmol Vis Sci,199637:161821624129Moncaster JA,Walsh DT,Gentleman SM,et al.Ergothioneinetreatment protects neurons against N2methyl2D2aspartate excitotox2icity in an in vivo rat retinal model.Neurosci Lett,2002,328:55259.(收稿日期:2007203209)综述视网膜血管手术操作技术的研究及临床应用高永峰 郭希让【摘要】视网膜血管手术操作技术主要包括视网膜动脉和静脉的穿刺、插管、血管内注射药物和动脉内栓子的驱除等干预手段,目前不仅获得了较多的实验研究结果,而且视网膜静脉注射组织型纤溶酶原激活剂治疗视网膜静脉阻塞也获得了初步效果,这项技术的发展可为视网膜血管疾病,特别是视网膜中央静脉阻塞和视网膜中央动脉阻塞,提供一种新的治疗方法。【关键词】视网膜血管;血管手术操作技术;视网膜静脉阻塞;视网膜动脉阻塞 作者单位:450003郑州,河南省眼科研究所通讯作者:高永峰,Email:gaoyf02 目前许多致盲性视网膜血管疾病尚无理想的治疗方法,其主要原因是药物难以有效地到达病变部位1。视网膜组织娇嫩、其血管直径也较小,一直被认为是手术操作的禁区。近年来,随着玻璃体视网膜手术技术的完善和微型操作器械的精细化,视网膜血管手术操作技术在视网膜血管病变治疗方面的潜在价值引起了很大关注。一、视网膜血管插管技术根据全身大器官血管成形术和血管再通技术的成功经验,考虑到玻璃体视网膜手术过程中可以直接靠近视网膜血管,许多学者认为视网膜血管操作技术的设想是合理的。其关键步骤是微型导管可以进入视网膜血管内。具有临床意义的方法是微型导管直接穿刺血管壁进入血管内。另一种方法是在血管壁上造孔后,微型导管由血管壁孔进入血管内。视网膜血管操作技术首先在离体眼球上进行实验。Tsilimbaris等2将离体猪眼在手术显微镜下制成眼杯。先使用玻璃体视网膜显微(MVR)刀尖、缝线针尖、30G针头或Er:YAG激光在血管壁上造孔,然后1020尼龙线、细聚酰亚胺导管或细玻璃导管通过血管壁孔进行插管,其中导管的尖端弯曲一定程度,以便导管顺利进入血管。实验还进一步尝试了血管内注射、血管的分离和移位,甚至2个血管之间的细导管连接技术,也获得成功。结果表明,几种经典的视网膜血管手术操作均具有可行性。Tsilimbaris等2认为视网膜血管插管的主要问题是血管直径和导管直径的匹配。因为人视盘周围的视网膜血管直径110m左右3,而他们使用的聚酰亚胺导管的内部直径50m,管壁厚716m,因此视网膜血管插管获得成功。Tang等4在离体人眼球上进行了类似的视网膜血管插管技术操作。使用20G MVR刀尖在视网膜血管壁上造孔后,将1020尼龙线从视网膜血管壁孔插入血管腔内。如果1020尼龙线在视网膜血管内移动无阻力,则提示插管成功。但病理观察发现1020尼龙线不能穿过筛板进入视神经的血管内。大部分视网膜中央静脉阻塞(CRVO)和视网膜中央动脉阻塞(CRAO)的病变即位于筛板区5,因此插管到达筛板区域即可达到效果。如果机械性导管的弹性和力度理想,也可能直接将血栓或栓子破坏。此外,还可以通过插管将药物注射到血栓或栓子部位直接溶栓。此研究结果为进一步临床应用提供了理论依据。Glucksberg等6使用直径25m、弯曲2030度的微导管尖端,在活体猫视网膜动脉和静701国际眼科纵览2007年4月第31卷第2期 Int Rev Ophthalmol,April 2007,Vol 31,No.2