胞内游离Ca的测定方法.doc

Pluronic F-127 (F127)美国Molecular Probes Inc.产品。
Ultima型共聚焦激光扫描显微镜为美国 MERIDIAN Instruments Inc 产品。
1. 光源：Ultima型50Mw UV,200Mw Visible
2. 激发波长：351-364nm，488nm，514nm
3. 扫描系统：Ultima为台阶扫描，精度0.1um
目的：监测细胞胞浆中游离钙的动态变化
原理：正常细胞内游离钙浓度[Ca2┼]i为0.1 umol/L,胞外钙离子浓度为1.2-1.3mmol/L,相差达10000倍。胞外钙内流和胞内钙库动员形成的钙震荡(钙峰或钙波)在各种生理过程中起重要作用；病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱,直至细胞坏死或凋亡；钙离子通道阻断剂已广泛应用于临床。显而易见,测定[Ca2┼]i在生理学、病理学和药理学等研究工作中均具有重要意义。
Fluo-3/AM等钙离子荧光染料以脂溶性的乙酰甲氧基酯（AM酯）的形式导入细胞，在胞内水解酶的的作用下水解成游离酸，与钙离子的结合物在激发光作用下能产生特异的荧光。荧光信号的强弱随钙离子浓度的变化而变化。

100ug Fluo-3/AM 溶于 100ul DMSO中，就是1ug/ul,1mg/ml,1g/L
方法：1.预先用二甲基亚砜(DMSO)将Fluo-3/AM配制为1mmol/L(1g/L)原液,-20oC避光保存。F127用DMSO配制成20%溶液(W/V)。用无血清无酚红培养液将Fluo-3/AM稀释成终浓度为10umol/L，并加入0.1％的Pluronic F-127备用。2.移去培养皿中的原培养液，用PBS液冲洗心肌细胞2遍，加入10umol/L染料液1ml，置于37oC的CO2孵箱里避光温育30min。
3.将染色后的心肌细胞用PBS液冲洗3遍，加入1mlDMEM液后置于20倍光学显微镜观察区域及层面，用LSCM观察Fluo-3染色的细胞的某一层面的荧光图像。
4.启动LSCM，选择488nm氩离子激光，启动计算机，运行lasersharp2000软件，选择time-course程序，设置扫描间隔时间（30sec）、扫描次数（300次），开始扫描。
5.将数据输入excel进行整理、统计、分析。
一、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定

按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA，能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，与EGTA不同的是Fura-2可发出荧光，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。Fura-2为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2，与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。并且，Fura-2与Ca2+解离容易，随着游离Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。因此，Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系，据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。
Fluo-3/AM是继Fura-2/AM等之后研制的新一代Ca2+ 荧光指示剂，与Fura-2/AM类似，Fluo-3/AM进入细胞后，酯基被水解掉，Fluo-3与细胞内游离Ca2+ 结合，因而其荧光强度可以反映细胞内游离Ca2+ 的浓度。但优于Fura-2/AM的是，Fluo-3与Ca2+ 结合时的荧光强度较未结合Ca2+ 的游离形式高40 ~ 100倍，避免了自发荧光的干扰，因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。此外，Fluo-3与Ca2+ 亲和力低，易解离，适合测定细胞内Ca2+ 的快速、微量变化。Fluo-3 在可见光光谱激发，激发波长为488 nm，可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。Ca2+荧光探针用于检测[Ca2+]i的基本原理如图7.1所示。

图 Ca2+荧光探针检测[Ca2+]i的基本原理
a， 代表一个细胞模型；b，Ca2+荧光探针的负载；
c，Ca2+荧光探针去酯化；d，去酯化的Ca2+荧光探针与细胞质内游离Ca2+结合。
Fig. The mechanism for [Ca2+]i detection by fluorescent Ca2+ probe.
[Ca2+]i的检测方法根据文献(Pan, Z., et al., 2000)，并作适当的改进。具体过程如下：
1 Ca2+荧光探针负载
1. 以无菌D'-Hanks液清洗各处理细胞三次，加入适量的Fura-2/AM或Fluo-3/AM(终浓度为4 µM)和Pluronic-F127(终浓度为0.05%)，避光，37℃恒温轻轻振荡，孵育45 min。
2. 负载后的细胞以含0.2%牛血清白蛋白的Hanks液清洗两次，Hanks液清洗一次，以充分洗去细胞外未负载的残余荧光染料。
3. 按上所述，向各实验组细胞中加入相应的孵育缓冲液，室温放置20 min，按实验设计作相应检测。
2 Ca2+荧光强度的测定
2.1 荧光双波长分光光度计测定[Ca2+]i
1. Fura-2的荧光强度测定用日立F-3000型荧光双波长分光光度计进行。测定条件为：激发光光栅5 nm，发射光光栅10 nm，测定温度为(37±1)℃。
2. 取一定量(1×106个细胞)负载Fura-2/AM的细胞悬液，加入到测量用荧光杯中，在上述测定条件下，以激发光波长300 ~ 450 nm，发射光波长500 nm进行扫描，检查荧光峰值达最高时的激发波长，判断细胞负载情况，以峰值在340 nm左右处为最佳负载状态。
3. 将测定方式转换为改变波长的时间扫描(波长变换间隔为2秒)，按以上参数执行双波长测定。
4. 测定最大荧光比值(Rmax)和最小荧光比值(Rmin)：加破膜剂Triton X-100(终浓度为0.1%)，使Fura-2和Ca2+结合达饱和时，测得的F340/F380为Rmax；加入高浓度的Ca2+螯合剂EGTA(终浓度为5 mM, pH8.5)，以充分螯合Ca2+，使Fura-2游离，测得的F340/F380为Rmin。
2.2 激光共聚焦显微镜测定[Ca2+]i
1. 对于1组实验中的细胞，直接取细胞皿置激光共聚焦显微镜的载物台上，以488 nm的氩激光激发Fluo-3产生绿色荧光，观察各皿中细胞的形态、细胞中Ca2+ 的荧光强度及分布变化，拍照。
2. 对于其他组的细胞样品，置激光共聚焦显微镜的载物台上，连续动态扫描选定细胞内Ca2+荧光强度的变化。激发波长为488 nm，发射波长为515 nm，采样频率为488 Hz, 每隔20 sec扫描一次。细胞内Ca2+ 荧光强度变化图像由随机软件进行分析处理，得到细胞内Ca2+ 变化(相对荧光强度值)的时间 ~ 效应曲线，再转换为时间 ~ [Ca2+]i曲线。
激光扫描参数在整个实验过程中不变。为保证实验结果具有良好的重现性，每实验组先后重复3次，结果重复性良好。
2.3 [Ca2+]i的计算
根据Grynkiewicz, G.等(1985)提出的经典公式计算细胞内游离Ca2+([Ca2+]i)的浓度。
Fura-2/AM检测的[Ca2+]i计算公式为：
[Ca2+]i = Kd[(R-Rmin)/(Rmax-R)](Fmin/Fmax)
其中，Kd为Fura-2与Ca2+反应的解离常数，为224 nM；R为各测定点F340/F380荧光强度比值；Rmax、Rmin分别为上述测定的最大和最小荧光比值；Fmin、Fmax分别代表Ca2+为零及饱和时，在380 nm激发光下测得的Fura-2荧光强度(F380)。实际计算由日立F-3000钙测定系统钙定量软件自动求出。
Fluo-3/AM检测的[Ca2+]i计算公式为：
[Ca2+]i = Kd[(F-Fmin)/(Fmax-F)]
其中，Kd为Fluo-3的解离常数，为400 nM；F为对样品检测得到的荧光强度值，Fmax、Fmin分别为加0. 程如下：
1 Ca2+荧光探针负载
1. 以无菌D'-Hanks液清洗各处理细胞三次，加入适量的Fura-2/AM或Fluo-3/AM(终浓度为4 µM)和Pluronic-F127(终浓度为0.05%)，避光，37℃恒温轻轻振荡，孵育45 min。
2. 负载后的细胞以含0.2%牛血清白蛋白的Hanks液清洗两次，Hanks液清洗一次，以充分洗去细胞外未负载的残余荧光染料。
3. 按上所述，向各实验组细胞中加入相应的孵育缓冲液，室温放置20 min，按实验设计作相应检测。
2 Ca2+荧光强度的测定
2.1 荧光双波长分光光度计测定[Ca2+]i
5. Fura-2的荧光强度测定用日立F-3000型荧光双波长分光光度计进行。测定条件为：激发光光栅5 nm，发射光光栅10 nm，测定温度为(37±1)℃。
6. 取一定量(1×106个细胞)负载Fura-2/AM的细胞悬液，加入到测量用荧光杯中，在上述测定条件下，以激发光波长300 ~ 450 nm，发射光波长500 nm进行扫描，检查荧光峰值达最高时的激发波长，判断细胞负载情况，以峰值在340 nm左右处为最佳负载状态。
7. 将测定方式转换为改变波长的时间扫描(波长变换间隔为2秒)，按以上参数执行双波长测定。
8. 测定最大荧光比值(Rmax)和最小荧光比值(Rmin)：加破膜剂Triton X-100(终浓度为0.1%)，使Fura-2和Ca2+结合达饱和时，测得的F340/F380为Rmax；加入高浓度的Ca2+螯合剂EGTA(终浓度为5 mM, pH8.5)，以充分螯合Ca2+，使Fura-2游离，测得的F340/F380为Rmin。
2.2 激光共聚焦显微镜测定[Ca2+]i
3. 对于1组实验中的细胞，直接取细胞皿置激光共聚焦显微镜的载物台上，以488 nm的氩激光激发Fluo-3产生绿色荧光，观察各皿中细胞的形态、细胞中Ca2+ 的荧光强度及分布变化，拍照。
4. 对于其他组的细胞样品，置激光共聚焦显微镜的载物台上，连续动态扫描选定细胞内Ca2+荧光强度的变化。激发波长为488 nm，发射波长为515 nm，采样频率为488 Hz, 每隔20 sec扫描一次。细胞内Ca2+ 荧光强度变化图像由随机软件进行分析处理，得到细胞内Ca2+ 变化(相对荧光强度值)的时间 ~ 效应曲线，再转换为时间 ~ [Ca2+]i曲线。
激光扫描参数在整个实验过程中不变。为保证实验结果具有良好的重现性，每实验组先后重复3次，结果重复性良好。
2.3 [Ca2+]i的计算
根据Grynkiewicz, G.等(1985)提出的经典公式计算细胞内游离Ca2+([Ca2+]i)的浓度。
Fura-2/AM检测的[Ca2+]i计算公式为：
[Ca2+]i = Kd[(R-Rmin)/(Rmax-R)](Fmin/Fmax)
其中，Kd为Fura-2与Ca2+反应的解离常数，为224 nM；R为各测定点F340/F380荧光强度比值；Rmax、Rmin分别为上述测定的最大和最小荧光比值；Fmin、Fmax分别代表Ca2+为零及饱和时，在380 nm激发光下测得的Fura-2荧光强度(F380)。实际计算由日立F-3000钙测定系统钙定量软件自动求出。
Fluo-3/AM检测的[Ca2+]i计算公式为：
[Ca2+]i = Kd[(F-Fmin)/(Fmax-F)]
其中，Kd为Fluo-3的解离常数，为400 nM；F为对样品检测得到的荧光强度值，Fmax1% Triton X-100及5 mM EGTA 时测得的荧光强度值。