动物源性食品中氯霉素类药物的LC-MSMS定量分析方法.pdf

56一、背景氯霉素（Chloramphenicol）是一种广谱抗生素，其对伤寒杆菌、流感杆菌、副流感杆菌和百日咳杆菌的作用良好，对立克次体感染如斑疹伤寒也有效，但对革兰阳性球菌的作用不及青霉素和四环素。氯霉素对人类的毒性较大，它会引起再生障碍性贫血、新生儿灰色综合症等疾病，尤其是氯霉素的低浓度药物残留会诱发致病菌的耐药性。食品中氯霉素的残留不但对人体造成危害，而且该药已在国外较多国家禁用，严重影响我国食品的出口，因此准确测定食品中氯霉素的残留量具有重要意义。目前GB/T 22338-2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定中详细介绍了水产品、畜牧产品和畜牧副产品中氯霉素类化合物残留量的气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法，方法中采用内标法定量检测氯霉素，以及外标法对甲砜霉素和氟甲砜霉素进行定量。本文中将详细介绍采用AB SCIEX 3200 QTRAP LC-MS/MS检测氯霉素，并且经实验证实AB SCIEX API 4000系列、API 5000以及API 5500系列同样适用于该方法。二、化合物信息动物源性食品中氯霉素类药物的LC-MS/MS定量分析方法表1.化合物基本信息化合物 英文通用名 分子量 CAS 分子式氯霉素 Chloramphenicol 323.1 56-75-7 C11H12Cl2N2O5甲砜霉素 Thiamphenicol 355.0 15318-45-3 C12H15Cl2NO5S氟甲砜霉素 Florfenicol 357.0 73231-34-2 C12H14Cl2FNO4S三、前处理方法（GB/T22338-2008）1.样品提取1.1.动物组织（肝、肾除外）与水产品称取试样5 g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，加入100 L氯霉素氘代内标（氯霉素-D5）工作溶液和30 mL乙腈，匀浆，离心5 min。将上清液转移至250 mL分液漏斗中，加入15 mL乙腈饱和的正己烷，振荡5 min，静置分层，转移已经层至100 mL棕色心形瓶中。残渣中再加入30 mL乙腈，振摇3 min，离心5 min，取上清液转移至同一分液漏斗，振荡5 min，静置分层，转移乙腈层至同一棕色心形瓶中。向心形瓶中加入5 mL正丙醇，于40水浴中旋转蒸发近干，用氮气吹干，加5 mL丙酮-正己烷（1+9）溶解残渣。1.2.动物肝、肾组织称取试样5 g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，加入30 mL乙酸钠溶液，均质2 min，加入300 L-葡萄糖醛酸苷酶，于37温育过夜。消解样品中加入100 L氯霉素氘代内标（氯霉素-D5）工作溶液和20 mL乙酸乙酯-乙醚（75+25），振荡2 min，离心5 min。取上层有机层入心形瓶中，在40水浴中旋转蒸发近干，用氮气吹干，加5mL丙酮-正己烷（1+9）溶解残渣。1.3.蜂蜜称取蜂蜜试样5 g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，加入100 L氯霉素氘代内标（氯霉素-D5）工作溶液，5 mL水混匀。再加入20 mL乙酸乙酯，振摇2 min，离心5 min，移取有机层到100 mL棕色心形瓶中。于离心管中在加入20 mL乙酸乙酯，振摇2 min，离心5 min，合并有机层至同一棕色心形瓶中，于40水浴中旋转蒸发至干，加3 mL水溶解残渣，混匀。57动物源性食品中氯霉素类药物的LC-MS/MS定量分析方法2.净化2.1.动物组织与水产品用5 mL丙酮-正己烷淋洗LC-Si硅胶小柱，弃去淋洗液，将残渣溶解溶液转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，用5 mL丙酮-正己烷（6+4洗脱，收集洗脱液于心形瓶中，40水浴中旋转蒸发近干，用氮气吹干，加1 mL水定容，定容液过0.45 m滤膜至进样瓶，待测定。2.2.蜂蜜分别用5 mL甲醇，5 mL水活化EN固相萃取住，将提取液转移上柱，用5 mL水淋洗，用玻璃棒压干1 min，用3 mL乙酸乙酯洗脱，洗脱液用氮气吹干，用1 mL水定容，定容液过0.45 m滤膜至进样瓶，待测定。四、实验方法1.液相条件色谱柱：Phenomenex Aqua 2.0X50mm，5 m；柱温：45；流速：400 L/min；流动相：A，水；B，乙腈；梯度洗脱，洗脱条件见表2：2.质谱条件离子源：Turbo V离子源；扫描模式：负离子采集模式：多反应监测MRM表2.液相色谱条件时间（min）A（%）B（%）0 75 15 0.5 75 15 4 50 50 5 50 50 5.2 75 15 8 75 15表3.氯霉素类化合物MRM离子对化合物名称 母离子 子离子1 子离子2氯霉素 321 152 257甲砜霉素 354 185 290氟甲砜霉素 356 336 185氯霉素-D5（内标）326 157 582.定性线性曲线2.1.氯霉素（0.0051 ng/mL）y=1.03850e6 x+895.10620（r=0.99809）（weighting:1/x2）Levels已知浓度（ng/mL）实测浓度（ng/mL）准确度（%）100050.005102.620.0100.01098.730.0200.01891.840.0500.050100.250.1000.102101.960.2000.19597.370.5000.48797.381.0001.101110.2 2.2.氟甲砜霉素（0.0051 ng/mL）y=1.10818e6 x+921.19434（r=0.99873）（Weighting:1/x2）Levels已知浓度（ng/mL）实测浓度（ng/mL）准确度（%）10.0050.005104.620.0100.00991.130.0200.02097.840.0500.052103.950.1000.101100.860.2000.19698.270.5000.511102.281.0001.015101.5五、定量质谱数据1.色谱图示例592.3.甲砜霉素（0.011 ng/mL）y=3.59685e5 x+683.73073(r=0.99913)(weighting:1/x2)Levels已知浓度（ng/mL）实测浓度（ng/mL）准确度（%）10.0100.01097.820.0200.021102.830.0500.051102.840.1000.105105.350.2000.19396.560.5000.48797.571.0000.97497.410.0100.01097.8六、重现性数据鱼肉基质样品连续6针进样峰面积的重现性。氯霉素氟甲砜霉素甲砜霉素浓度平均值（ng/mL）0.0060.860.94平均峰面积（RSD%）6.765e3（4.6%）9.538e5（1.8%）3.406e5（1.3%）七、结论7.1 采用AB SCIEX系列串联三重四极杆质谱，灵敏度完全可满足食品中氯霉素类抗生素测定最严格的法规要求。7.2 可精确定量分析，特别是在分析复杂基质样品中氯霉素残留时，实验结果可看到低浓度同样具有良好的重现性以及准确性。动物源性食品中氯霉素类药物的LC-MS/MS定量分析方法