兽药30天和90天喂养试验指导原则.pdf

兽药 30 天和 90 天喂养试验指导原则 一、概述（一）定义与目的 当评价某受试药物的毒作用特点时，在了解受试药物的纯度、溶解特性、稳定性等理化性质和有关毒性的初步资料之后，可进行30天或90天喂养试验，以提出较长期喂饲不同剂量的受试药物对动物引起有害效应的剂量、毒作用性质和靶器官，估计亚慢性摄入的危险性。90天喂养试验所确定的最大未观察到有害作用剂量可为慢性试验的剂量选择和观察指标提供依据。为了确保30天或90天喂养试验结果的真实性、可靠性和可追溯性，根据新兽药研究的规律，结合国内兽药毒理学评价的实际情况制定了本指导原则。（二）适用范围 本指导原则适用于评价兽用化学药品、中兽药、消毒剂及饲料药物添加剂对动物引起的有害效应。二、试验设计（一）材料与方法 1.实验动物 选择啮齿类动物大鼠。为了观察受试药物对动物生长发育的影响，使用雌、雄两种性别的离乳大鼠（出生后 4 周）。试验开始时动物体重的差异应不超过平均体重的士 20。2.试剂（1）哺乳动物血球计数配套试剂。（2）血液生化学指标测定配套试剂。（3）组织标本固定用试剂（4）组织病理学检查常用试剂 3.主要仪器（1）生物显微镜（2）全自动生化分析仪（3）血球计数仪（4）组织病理学检查常用仪器设备（二）试验步骤 1.剂量组设计 设 35 个剂量组和一个对照组。剂量选择高剂量组的动物在喂饲受试药物期间应当出现明显的中毒症状但不造成死亡或严重损害；低剂量组不引起毒性作用，从而估计或确定出最大未观察到有害作用剂量；在高剂量和低剂量之间再设13 个剂量组，以期获得比较明确的剂量-反应关系。剂量的设计可参考以下原则：（1）以 LD50 1025为 30d 或 90d 喂养试验的最高剂量组，此 LD50百分比的选择主要参考 LD50剂量反应曲线的斜率。然后在此剂量下设几个剂量组。最低剂量不能低于靶动物可能摄入量的 3 倍。（2）对于求不出 LD50的受试药物：30 天喂养试验应尽可能涵盖靶动物可能摄入量 100 倍的剂量。对于靶动物摄入量较大的受试药物，高剂量组可以按最大耐受剂量设计。90 天喂养试验根据 30 天喂养试验结果确定剂量，或者以靶动物的可能摄入量的 100300 倍作为最大未观察到有害作用剂量，然后在此剂量以上设几个剂量组，必要时亦可在此剂量以下增设剂量组。每个剂量组至少 20 只动物，雌、雄各半。如果在试验间期要处死实验动物进行检查，则需适当增加各组动物数。2.试验动物标记称重、标记编号和分组 试验前购置离乳大鼠（出生后 4 周），雌、雄各半，饲养观察 35 天。分别选择健康雌、雄大鼠进行称重和标记编号，采用完全随机法，将其分为 46组，每组两种性别大鼠均不得低于 10 只。3.给药方案 首选将受试药物混入饲料中喂养（注意受试药物在饲料中的稳定性）。如有困难，也可加入饮水中或灌胃。当受试药物混入饲料时，需将受试药物给予剂量，按大鼠每日饲料摄入量折算为饲料中受试药物浓度（mg/kg），30天喂养试验大鼠每日饲料摄入量按体重的10%折算，90天喂养试验大鼠每日饲料摄入量按体重的8%折算。饮水给予受试药物时，动物每日饮水量按体重的1520%计算。灌胃时，大鼠灌胃量按1mL/（100g体重日）计算。每天灌胃的时间点也应一致。4.试验观察 试验期间，每天观察记录动物的一般行为表现、中毒及死亡情况；并同时记录大鼠饮水投入量和饮水剩余量；按周时间段测量记录实验大鼠体重、投入饲料量及剩余饲料量。5.检测（1）血液学指标 必测血液学指标包括血红蛋白（Hg），红细胞计数（Ec），白细胞计数（Lc）及嗜中性（NL）嗜酸性（AL）、嗜碱性（BL）、淋巴（LM）、单核（ML）的分类计数等，必要时增加测定血小板数（Pl）和网织红细胞数（Rc）。30天喂养试验一般于试验结束时测定一次，90天喂养试验一般于试验中期和结束时各测定一次。各组不少于10只大鼠（雌、雄各半）采血进行血液学指标测定。（2）血液生化指标 必测血液生化指标包括谷丙转氨酶（ALT或SGPT）、谷草转氨酶（AST或SGOT）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、血糖（Glu）、血清白蛋白Alb）、总蛋白（TP）、总胆固醇（TCH）和甘油三酯（TG）等。30天喂养试验一般于试验结束时测定一次，90天喂养试验一般于试验中期和结束时各测定一次。各组不少于10只大鼠（雌、雄各半）采血进行生化指标测定。（3）病理检查 大体解剖 30天喂养试验于试验结束，90天喂养试验于试验中期和试验结束，各组取10只大鼠（雌、雄各半）进行剖检（可结合采血进行）。做好记录，并将重要器官和组织固定保存。脏器称量 剖检试验大鼠的同时，称取大鼠体重及各主要脏器（包括肝、肾、脾、胃肠、睾丸、肺、心、卵巢子宫等）重量，做好记录。计算各脏器的相对重量（脏/体比值）。组织病理学检查 对高剂量组及对照组大鼠的主要脏器进行组织病理学检查，发现病变后再对较低剂量组大鼠的相应器官及组织进行检查。肝、肾、脾、胃肠、睾丸及卵巢的组织病理学检查为必测项目。6.试验记录 逐项记录受试药物编号、样品名称、检测依据、检验项目、检验开始日期及完成日期、检验结论等；实验动物的来源、合格证号、实验动物许可证号、种属和品系、年龄、体重范围、数量、性别、购置日期、健康状态等；各项观察结果及数据等。（三）试验结果整理及数据分析 1.数据整理 （1）整理归纳各试验组大鼠的临床表现。（2）整理试验大鼠的饮水量,求取各剂量组大鼠饮水量的平均值(表述为xs）。（3）整理大鼠的饲料摄入量和增重,求取各剂量组大鼠的平均增重率(表述为xs）。（4）整理测得的血液学指标，求取各指标的组内平均值(表述为xs）。（5）整理测得的血液生化指标，求取各指标的组内平均值(表述为xs）。（6）整理测得的大鼠体重及其主要脏器重量，计算脏/体比值(脏器系数),求取各试验组大鼠脏器系数的平均值(表述为xs)。（7）归纳各试验组大鼠剖检和组织病理学检查结果，并与对照组进行比较分析。2.数据分析 以适当的统计学方法分析上述整理的数据，比较试验组与对照组之间的差异显著性。计量资料采用方差分析或 t 检验，计数资料采用 X2检验、泊松分布等。（四）结果评价 1.综合试验观察结果，评价受试药物作用下大鼠的临床表现。2.结合数据评价受试药物对大鼠增重率、饮水量及总体生长情况的影响。3.结合数据评价受试药物对大鼠血液学指标和血液生化指标的影响。4.评价受试药物各剂量对大鼠脏器系数的影响。5.评价受试药物各剂量给大鼠组织器官造成的病理变化。（五）注意事项 1.除特别注明外，试验用水为蒸馏水，试剂为分析纯试剂，动物为 SPF 实验动物。2.实验动物饲养环境要求达到 SPF 级。三、试验报告 为公正、科学地评价药物的毒性，对试验报告内容做如下要求：1.试验目的。2.试验时间与地点。3.试验设计者、负责人、参加者及电子邮箱。4.受试药物需注明兽药名称、生产厂家、规格、生产批号及用法与用量。5.试验动物的品种与品系、体重、日龄或月龄、健康状况、检疫情况等 6.归纳总结该药物的试验结果，确认受试药物引起有害效应的剂量、毒作用性质和靶器官等，估计亚慢性摄入的危险性。7.参考文献。8.试验数据，应有详细的试验原始记录。原始资料保存处、联系人、电话。9.试验单位（加盖公章）。四、附录 附表 啮齿动物中毒表现观察项目 器官系统 观察及检查项目 中毒后一般表现 行为 改变姿势，叫声异常，不安，呆滞 中枢神经系统 及躯体运动 动作 震颤，运动失调，麻痹，惊厥，强直性动作 各种刺激的反映 易兴奋，知觉过敏或缺乏知觉 大脑及脊髓反射 减弱或消失 肌肉张力 强直或弛缓 瞳孔大小 缩小或放大 自主神经系统 分泌 流涎，流泪 鼻孔 流鼻涕 呼吸系统 呼吸性质和速率 徐缓，困难，潮式呼吸 心血管系统 心区触诊 心动过缓，心律不齐，心跳过强或过弱 腹形 气胀或收缩，腹泻或便秘 胃肠系统 粪便硬度和颜色 粪便不成形，黑色或灰色 阴户，乳腺 膨胀 阴茎 脱垂 生殖泌尿系统 会阴部 污秽 颜色，张力 发红，皱褶，松弛，皮疹 皮肤和被毛 完整性 竖毛 粘膜 流粘液，充血，出血性紫绀，苍白 粘膜 口腔 溃疡 眼睑 上睑下垂 眼球 眼球突出或震颤 眼 透明度 混浊 直肠或皮肤温度 降低或升高 其他 一般情况 姿势不正常，消瘦