淀粉酶发酵条件的优化2.doc

本科学生综合性实验报告

学号 084120402 姓名 茶金梅
学院 生命科学 专业、班级 08生技
实验课程名称 酶工程实验
教师及职称 李俊俊
开课学期 2010 至 2011 学年 上 学期
填报时间 2011 年 12 月 29 日

云南师范大学教务处编印

一．实验设计方案
实验序号
三
实验名称
淀粉酶产生菌的发酵条件优化
实验时间
2010年12月
实验室
生物基础2
1． 实验目的
了解酶制剂生产过程中实验室发酵条件优化的基本方法。
2． 实验原理、实验流程或装置示意图
2.1 实验原理
⑴ 用微生物生产酶制剂受以下制约：培养基成分、物理条件。
⑵ 为了得到最佳产酶量，必须对这些因素进行优化，并通过单因子分析、正交试验找出最适合的发酵工艺条件。
① 碳、氮源是组成微生物细胞蛋白质、酶和核酸的主要元素之一，是影响酶产量的两个重要因素。
② α-淀粉酶产生菌的发酵是好氧过程，因而发酵液中的溶氧浓度是发酵过程中的一个需要调节的重要参数。
③ 接种量大小是决定菌体在发酵培养基中生长速度的一个重要因素，选择适当的接种量是必要的。
④ pH是决定菌体在发酵培养基中生长速度的一个重要因素，因此最适pH的选择就显得格外重要。
⑤ 发酵时间的长短决定了反应是否能完全发生，因此发酵时间也是发酵过程中的一个需要调节的重要参数。
⑶ 正交试验：用正交表来安排实验分析和实验结果。
① 正交试验设计一般来说包括两部分:试验设计，也即方案的选择与确定； 数据处理，进行统计推断。
② 正交试验设计的基本步骤：
第一步，确定目标、选定因素（包括交互作用）、确定水平；
第二步，选用合适的正交表；
第三步， 按选定的正交表设计表头，确定试验方案；
第四步，组织实施试验；
第五步，试验结果分析。
③ 正交试验的结果分析：极差分析、方差分析。
方差分析：将总的离差平方和分解成各因素及各交互作用的离差平方和，构造F统计量，对各因素是否对试验指标具有显著影响，作F检验。
④ 确定最优方案
如果不考虑交互作用，则根据各因素在各水平下的总产量或平均产量的高低确定最优方案；如果考虑交互作用，则取各种搭配下产量的平均数，按优化标准确定最优方案。
2.2 实验流程
配制种子培养基
接种 摇瓶发酵 测酶活
配制发酵培养基
确定最佳方案
分析实
验结果
3．实验设备及材料
3.1设备
250mL三角瓶、 移液管、大试管、培养皿、电子天平、超净工作台、培养箱、恒温调速摇瓶柜、离心机（离心管）、恒温水浴锅、分光光度计、比色皿、记时器、电冰箱、
3.2 试剂
蛋白胨、酵母膏、NaCl、葡萄糖、NH4NO3、KH2PO4、 MgCl2·6H2O、 CaCl2·2H2O
4．实验方法步骤及注意事项
4.1 试验方法步骤
4.1.1 种子培养基的配制
蛋白胨 1.0%
酵母膏 1.0g% pH5.5
NaCl 0.5%
将菌种接种到装有种子培养基的250mL三角瓶内，于37℃，200rpm，培养16h。
4.1.2 单因子分析
4.1.2.1 碳源浓度对发酵产酶的影响
在六只250ml三角瓶中，依次加入0.35g（0.5%）、0.70 g（1.0%）、1.05 g（1.5%）、1.40 g（2.0%）、1.75 g（2.5%）、2.10 g（3.0%）葡萄糖，然后在六只三角瓶中都加入0.7 g NH4NO3、0.07g KH2PO4、0.035 g MgCl2·6H2O、 0.007 g CaCl2·2H2O和70ml蒸馏水，搅拌溶解，调pH至6.0，高压灭菌，冷却后各接入11.2ml（16%）的种子培养基，相同培养条件下（37℃，72h，200rpm）摇瓶发酵，测定酶活。
4.1.2.2 氮源浓度对发酵产酶的影响
在六只250ml三角瓶中，依次加入0.35g（0.5%）、0.70 g（1.0%）、1.05 g（1.5%）、1.40 g（2.0%）、1.75 g（2.5%）、2.10 g（3.0%）NH4NO3，然后在六只三角瓶中均加入1.4g葡萄糖、0.07g KH2PO4、0.035 g MgCl2·6H2O、 0.007 g CaCl2·2H2O和70ml蒸馏水，搅拌溶解，调pH至6.0，高压灭菌，冷却后各接入11.2ml（16%）的种子培养基，相同培养条件下（37℃，72h，200rpm）摇瓶发酵，测定酶活。
4.1.2.3 培养基pH对产酶的影响
在七只三角瓶中各加入1.4g葡萄糖、0.7g NH4NO3、0.07g KH2PO4、0.035 g MgCl2·6H2O、 0.007 g CaCl2·2H2O和70ml蒸馏水，搅拌溶解，pH依次调至3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5，高压灭菌，冷却后各接入11.2ml（16%）的种子培养基，相同培养条件下（37℃，72h，200rpm）摇瓶发酵，测定酶活。
4.1.2.4 发酵时间对产酶的影响
在六只三角瓶中各加入1.4g葡萄糖、0.7g NH4NO3、0.07g KH2PO4、0.035 g MgCl2·6H2O、 0.007 g CaCl2·2H2O和70ml蒸馏水，搅拌溶解，调pH至6.0，高压灭菌，冷却后各接入11.2ml（16%）的种子培养基，摇瓶发酵（37℃， 200rpm）48h、60h、72h、84h、96h、108h，测定酶活。
4.1.3 酶活的测定
4.1.3.1 稀释酶液
4.1.3.2
操作步骤
空白管
样品管A
样品管B
步骤1
吸取1.8mL淀粉底物溶液
吸取1.8mL淀粉底物溶液
吸取1.8mL淀粉底物溶液
步骤2
50℃保温5分钟
50℃保温5分钟
50℃保温5分钟
步骤3

加入待测酶液0.2毫升
加入待测酶液0.2毫升
步骤4
50℃精确保温10min
50℃精确保温10min
50℃精确保温10min
步骤5
加入3mLDNS试剂终止反应
加入3mLDNS试剂终止反应
加入3mLDNS试剂终止反应
步骤6
混合均匀
混合均匀
混合均匀
步骤7
加入0.2毫升待测酶液，沸水浴煮沸5min
沸水浴煮沸5min
沸水浴煮沸5min
步骤8
流水冷却
流水冷却
流水冷却
步骤9
加蒸馏水10mL，混匀
加蒸馏水10mL，混匀
加蒸馏水10mL，混匀
步骤10
OD540nm比色
OD540nm比色
OD540nm比色
4.1.4 正交试验
因素
4.1.4.1 根据碳源浓度、氮源浓度、pH、接种量对酶活性的影响，每个因素选取三个水平（水平即在因素的允许变化范围内，要进行试验的“ 点 ”）进行正交试验。
水平

A碳源浓度
B氮源浓度
C接种量
D pH
1
最优—0.5%
最优—0.5%
最优—2%
最优—0.5
2
最优
最优
最优
最优
3
最优+0.5%
最优+0.5%
最优+2%
最优+0.5

4.1.4.2 按照正交表——L9 表（L是正交表的代号，L右下角的数字表示试验次数）进行试验。
试验号
A
B
C
D
1
1
1
1
1
2
1
2
2
2
3
1
3
3
3
4
2
1
2
3
5
2
2
3
1
6
2
3
1
2
7
3
1
3
2
8
3
2
1
3
9
3
3
2
1
4.1.4.3 进行方差分析
4.1.4.4 得出最佳方案
4.2 注意事项
⑴ 灭菌锅使用时，先检查是否有水，再接通电源。
⑵ 试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落。
⑶ 移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头，实验结束后要及时清洗枪头。
⑷ 精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理。
⑸ 煮沸和用流水冲洗时要避免试管进水。
⑹ 接种时要保证在无菌环境下操作。
⑺ 分光光度计使用时应提前半小时接通电源，打开机器开关使仪器通电，自检。
⑻ 测酶活时，将对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用镜头纸擦干外壁，放入样品室。
⑼ 读数完毕，打开仪器盖板，关闭开关，将比色杯冲洗干净、浸泡于30％酒精中。
⑽ 水浴锅中的水量要超过试管中的液面。
⑾ 接种后应振荡接种瓶，使菌种充分与培养基混合。
⑿ 正交试验设计时，确定因素应根据试验目的，选取主要因素，略去次要因素；确定因素的水平时，应尽可能的保持各因素的水平数相同，以方便试验数据的处理。
5．实验数据处理方法
5.1 酶活的计算
酶活=[(0.9511x+0.0493)×1000×n]／﹙t×V×M﹚
（其中，0.9511x+0.0493：葡萄糖的标准曲线方程；x：OD值；n：稀释倍数；t：反应时间；V：酶液的体积；M：葡萄糖的分子量）

5.2 正交试验结果的分析
利用SPSS对正交试验结果进行方差分析，得出实验的最佳方案。
6．参考文献
[1] 余龙江．发酵工程原理与技术应用．北京：化学工业出版社，2006
[2] 陈守文．酶工程．北京：科学出版社，2008
[3] 安戈等.1株酸性α-淀粉酶产生军的鉴定及发酵条件优化.安徽农业科学，2009
[4] 刘建军,姜鲁燕. 根霉PE-8菌株的选育及其淀粉降解酶类的研究 1998(02)
[5] 孙君社.酶与酶工程及其应用.北京：化学工业出版社.2006
[6] 李春喜等.生物统计学（第四版）.北京：科学版社.2008
二．实验报告
1．实验现象与结果
1.1 实验现象
⑴ 发酵培养基经灭菌后颜色会发生变化，由原来的白色变为亮黄色。
⑵ 摇瓶培养后，三角瓶中溶液的上方会出现一圈沉淀物。
⑶ 沸水煮沸5min后，溶液的颜色加深并且空白管中溶液的颜色比其余两管的要浅一些。
⑷ 做正交试验时，摇瓶培养后三角瓶中出现了一些球状物。
1.2 实验结果
1.2.1 碳源（葡萄糖）浓度对发酵产酶的影响
碳源浓度（%）
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
A管的OD值
1.152
1.515
1.725
1.987
3.764
2.931
B管的OD值
1.234
1.496
1.656
2.001
3.988
2.656
平均值
1.193
1.5055
1.6905
1.994
3.876
2.7935
酶活
32.888
41.144
46032
54.050
103.771
73.803
1.2.2 氮源（NH4NO3）浓度对发酵产酶的影响
N源浓度(%)
0.5
1
1.5
2.0
2.5
3.0
A管的OD值
0.042
-0.057
-0.094
0.032
0.055
0.004
B管的OD值
0.043
-0.023
-0.020
0.051
0.057
0.005
平均值
0.043
-0.040
-0.057
0.042
0.056
0.0045
酶活
5.010
0
0
4.958
5.698
2.977
1.2.3 培养基pH对产酶的影响
pH
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
A管的OD值
0.019
-0.011
0.023
1.247
1.752
1.379
1.083
B管的OD值
0.013
-0.011
0.021
1.441
1.680
1.391
1.291
平均值
0.016
-0.011
0.022
1.344
1.716
1.385
1.187
酶活
1.792
0
1.951
36.877
46.705
37.960
32.729
1.2.4 发酵时间对产酶的影响
发酵时间（h）
48

60
72
84
96
108
A管的OD值
0.113
1.500
1.523
0.149
0.191
0.135
B管的OD值
0.115
1.621
1.630
0.158
0.194
0.178
平均值
0.114
1.446
1.577
0.154
0.195
0.157
酶活
4.381
39.572
43.033
5.438
6.521
5.517
1.2.5 正交试验
1.2.5.1 各个因素选取的三个水平
水平
A碳源浓度（%）
B氮源浓度（%）
C接种量
（ml）
D pH
1
2.0
2.0
14
5.0
2
2.5
2.5
16
5.5
3
3.0
3.0
18
6.0
1.2.5.1 正交试验的结果
1号试验结果
编号 试管
A
B
平均值
总体均值
1
2.197
2.102
2.150
2.104
2
2.164
2.148
2.156
3
1.989
2.023
2.006

2号试验结果
编号 试管
A
B
平均值
总平均值
1
2.165
2.264
2.215
2.144
2
2.112
2.151
2.132
3
2.041
2.131
2.086
3号试验结果
编号 试管
A
B
平均值
总平均值
1
0.183
0.181
0.182
0.179
2
0.172
0.176
0.174
3
0.177
0.182
0.180
4号试验结果
编号 试管
A
B
平均值
总平均值
1
1.739
2.296
2.018
1.093
2
1.375
0.690
1.033
3
0.421
1.765
1.093
5号试验结果
编号 试管
A
B
平均值
总平均值
1
0.249
0.355
0.302
1.168
2
1.686
2.012
0.849
3
1.201
1.135
0.168
6号试验结果
编号 试管
A
B
平均值
总平均值
1
1.315
1.295
1.305
1.287
2
1.274
1.30
1.287
3
1.292
1.281
1.287

7号试验结果
编号 试管
A
B
平均值
总平均值
1
1.076
1.075
1.076
1.073
2
1.067
1.069
1.068
3
1.072
1.081
1.077
8号试验结果
编号 试管
A
B
平均值
总平均值
1
1.875
1.883
1.879
1.808
2
1.763
1.729
1.746
3
1.795
1.802
1.799
9号试验结果
编号 试管
A
B
平均值
总平均值
1
1.965
2.016
1.991
1.981
2
1.897
2.114
2.006
3
1.997
1.896
1.947
正交表
试验号
OD平均值
酶活
（U/min.ml）
酶活平均值（U/min.ml）

1
2.150
58.171

56.956
2.156
58.330
2.006
54.367

2
2.215
59.889

58.022
2.132
57.696
2.086
56.480

3
0.182
6.178

6.090
0.174
5.966
0.180
6.125

4
2.018
54.684

37.864
1.033
28.661
1.093
30.246

5
0.302
9.348

12.985
0.849
23.800
0.168
5.808

6
1.305
35.847

35.530
1.287
35.371
1.287
35.371

7
1.076
29.799

29.736
1.068
29.585
1.077
29.823

8
1.879
51.012

49.129
1.746
47.478
1.799
48.898

9
1.991
53.971

53.715
2.006
54.367
1.947
52.808
1.2.3.2 正交方差分析结果

SPSS分析结果整理如下：
方差来源
平方和
自由度
方差
F
显著性
A
1156.816
2
578.408
16.494
极显著
B
496.166
2
248.083
7.074
极显著
C
6278.346
2
3139.173
89.516
极显著
D
615.736
2
307.868
8.779
极显著
误差
631.227
18
35.068

总和
9178.291
27

2．对实验现象、实验结果的分析及其结论
2.1 对实验现象的分析
由于发酵培养基的成分在灭菌的过程中会发生变化，因此培养基的颜色灭菌前后会有一定的变化。摇瓶培养后，三角瓶中溶液的上方有一圈沉淀物，说明已经发生了酶促反应，培养基中已有淀粉酶的存在了。沸水浴会使酶失活，而样品管中的酶液与底物在这之前已发生了反应，而空白管中的底物还来不及反应就已失活，故空白管中溶液的颜色要比样品管中溶液的颜色浅。摇瓶培养后三角瓶中出现了一些球状物，说明培养基已被污染。
2.2 对实验结果的分析
2.2.1 碳源浓度对发酵产酶的影响
当碳源浓度为2.5%时，淀粉酶的活性最高。
2.2.2 氮源浓度对发酵产酶的影响
当氮源浓度为2.5%时，淀粉酶的活性最高。
2.2.3 培养基pH对产酶的影响
当pH为5.5时，淀粉酶的活性最高。
2.2.4 发酵时间对产酶的影响
当发酵时间为为72h时，淀粉酶的活性最高。
2.2.5 正交试验结果分析
当碳源浓度为2.0%、氮源浓度为2.5%、接种量为16ml、pH为5.5时，淀粉酶的活性最高。
2.2.6 方差分析
碳源浓度、氮源浓度、接种量、pH对酶活的影响都达到了极显著的水平。
2.3 结论：
淀粉酶发酵条件的最优组合：碳源浓度为2.0%、氮源浓度为2.5%、接种量为16ml、pH为5.5。
2． 实验总结
3.1 本次试验的成功之处及其原因分析
本次实验虽然步骤繁多但经过各个小组的分工合作基本都完成了实验要求，大体上达到了实验的目的，得出了淀粉酶产生菌的发酵条件的最佳方案。究其原因我认为有以下几点：
⑴ 小组成员间良好的分工合作，既节约了时间又按质完成了实验
⑵ 老师对实验步骤的耐心讲解。
⑶ 实验过程中遇到问题时，及时向老师和同学请教，以免犯下不可弥补的错误。
⑷ 实验过程中按照实验步骤仔细、耐心地进行操作，不急于求成。
⑸ 课前做了一定的准备。
3.2 本次试验的失败之处及其原因分析
本次试验的失败之处在于酶活的测定误差较大，有时会出现负值，有时A、B两管的差距会有些大，而且酶活不是很高。这可能是由于我们在操作时一些细节做得不够，如计时和液体量吸取时的精确性。
此外，在做正交试验时，摇瓶培养后三角瓶中出现了一些球状物，这说明淀粉酶产生菌已被污染，这很有可能是由于在无菌操作时出了问题。
3.3 对自我的评价
通过本次实验，我深刻地认识到了分工合作的重要性，良好的分工合作有助于我们更高效地完成实验，而且也让我知道了课前做好预习的重要性，因为课前做好了预习有助于跟上老师的节奏，更好地理解实验内容、完成实验。此外，本次实验还使我深深地体会到了“细节决定成败”这一句话，因为在本次试验中只有规范地使用移液枪，精确地计时，才能得到准确的实验结果。另外，由于操作时没有严格地在无菌条件下进行以致于有两瓶淀粉酶产生菌被污染，因此如果有机会重做这个实验，我一定会严格按照实验步骤进行操作，更加地注意一些细节，争取做得更好。
除此之外，由于本次实验要求对结果进行方差分析，这也就帮我们巩固了生物统计学的知识，加强了我们的数据处理能力，体会到生物统计学的重要性。
教师评语及评分：

签名： 年 月 日