分光光度法测定_淀粉酶活性_涂祖新.pdf

第五卷第四期一九八七年十二月江西科学JIAN(子XlSCIE N CEVoDee。,服41987分光光度法测定a一淀粉酶活性涂祖折周和山熊占(江西省科学院微生物 研究所)提要碘一淀粉 复合物的吸光度月。,。,。与淀粉浓度呈直线关系。沉粉经a一淀粉酶3 7降解1 0mi n后,用氛化铜/盆 酸混合液中止反应。测定碘一淀扮复合 物在5 80 nm处的吸光度并根据公式R二(5/B)(1一Ax/月s)来计算a一淀粉 酶活性。口 1住=-71百目前,a一淀粉酶活性测定方法有多种,主要可分四类:淀粉降解法1、还原法t乞、色素生成法I,1和复合酶法召。我国轻工部颁标准法”J是属于淀粉降解法类型。它是通过定时从反应液中取样,稀碘液显色,用肉眼同标准色泽比较以确定反应 终点,根据达到终点所需的反应时间来计算酶活力。因为该法是靠肉眼来判定反应终点,所以可能造成一定的误差。在实验室内进行比较精细 的分析,需要一种 更为严格的定量方法。我们 结合实验室工乍的需要,建立了一种比较简便而又较精确的a一淀粉酶活性测定法。其原理是,碘与淀粉结合而显现的颜色随淀粉浓度提高而加深,在一定条件下其吸光度(姓)与淀粉 浓度呈直线关系。淀粉经“一淀粉酶作用后,经测定吸光度(几)来确定降解量并计算出酶 活力。讨料一与方法(一)仪器与试剂1.7 51G型分光光度计:上海第三分析仪器厂生产。2.浓碘液沙(KI4%+120.4%)准确称取49碘化钾和。.49碘,先用少量蒸馏水使碘完全溶解后,再定容至1叨ml,贮于棕 色瓶内。3.稀碘液四1:用前取3ml浓碘液稀释至1 00ml。4.缓冲液51:o.ZMpH6.o磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液:称取磷酸氢二钠(NaZHPO1211:()4 5.249、柠檬酸(C。H。07H:O)8.0 79,用蒸馏水溶解并定容至1oo oml。5.酶解反应终 止液:将1 0%氯化铜(CuC 12ZHZO八日3.7%盐酸(HC I)按1:9的比例混合。6.标准淀粉溶液(1。o%):取可溶性淀粉(浙江菱湖化工试剂厂产品)于称量杯中,1 05烘Zh后,精确称取29,加少量缓冲液,加热溶解至透明,冷却后用缓 冲 液 定容至2 00ml。7。膝液:按具体情况用缓冲液稀释(或配制)成适当的浓度。过滤去渣,置4保存。木文于1986年1 2月3 0日收到。分光光度法测定a一淀粉酶活性本试验用的酶干粉是 赣南酶制剂厂产品。(二)碘一淀粉复合物及稀碘液的吸光度(姓)曲线取1%淀粉溶液sm l,加入缓冲 液和终止液各1ml,用旋涡混合器 混匀后从中取出O。2 ml,用701稀碘 液显色。空 白对照管以sml缓冲液代替淀粉,其余同上。使用0.5。m光程的玻 璃比色杯,用751G型分光光度计测定碘一淀粉复合物在不同波长(几)处的吸光度(A)。测定稀碘液吸 光度(A)时,以蒸馏水为空白对照,结果见表1和 图1。由试验结果可知,在5 8Onm波长处,碘一淀粉 复合物的吸光度(A)最大,而稀碘液的 吸光度(A)很小。我们 选择58 0nm来测定淀粉含量。(三)淀粉浓度与吸光度(A)的关系在5ml不同百分浓度的淀粉溶液中,加入缓冲液和终止 液各1ml。混匀后分别取出o.Zml,用7ml稀碘液显色。在ssonm波长处,二“波长(1)图1琪一淀粉 复合物及稀腆液的吸光度曲线按(二)的方法测定各管的吸光度(A)。具体淀粉百分浓度及其对应的吸 光度(A)见表2。表1碘一淀粉复合物及稀碘液在不同波长处的吸光度入。,44046048 05 005 2 05理05 G05 8060 06206 6068 07007 207407 6078080 0碘一淀粉复合物。.75 0.86 0.9凌1,01.Q了1.14 1。2 1 1。24 1。231.12O.7 7 0.690.6 1 0.530.4 6 0.38 0.31 0.25入,。14 004 2 04 4 04 6 048050 0一盆二二二二二老爷二二一二二一盗,一 考任吮飞二二二忌 二一一_二一了一二下5205 4056058 0600620660稀碘 液1“。“”45。“”。6”“9。“5”。40。0 30。020。020。010。01表2试不 同淀粉浓度与吸光度的关系管一号淀粉浓度(%)淀粉量(mg)吸光度(A580)00。10。20。304介.50。(30.7f厂.80.9D5lOl52 O艺53O35404 5O0。130。260。39O。5 1O。6 10。740。87l。001.111 1飞o,501.23.2 8.江西科学1 987年第4期由试验结果可知,关系(见图2)。在本试验条件下,淀粉 量与其对 应 的吸光度(A)呈通过原点的直线(四)酶活力测定与计算1.操作 步骤用缓冲液将酶稀释成适当的各种浓度,各取lm l置不同 编 号 的试管内。标准 管用1ml缓冲液代替酶液。置3 7水浴2mi l l后,依次加入3 7预热的1.0%淀 粉5ml,立即混匀,3 7准确反应zomin。立即 加入1ml终止液,混匀、终止酶解反应。反应液降至 室温之后,取出o.Zml用7ml稀碘 液显色,测定各管的 吸光度(A)。2。酶活力计算在本试验条件下,每分钟内能降 解1mg淀粉的酶量定为一个 酶活力单位(U)。1mg酶干粉所含有的活力单位数定为比活力(U/mg)。习2基二工淀粉员(mg)图2淀粉 量与吸光度的关系因为淀粉量(W)与其吸光度(A)成正 比关系(见图2)。即:所以,平x_Ws寿一不Wx=Ws.五As(2)式中,Wx为样品管中经酶作用后残留的淀粉量;Ax为样品管的吸光度,万s为标准管中的淀粉量,As为标准管的吸光度。因为酶解前样品管内淀粉量为5ml1.0%的淀粉(即5 0mg),所以淀粉降解量为5 0一W二mg)则该样品管内酶的活力单位(U)为:u二.丝上卫玉105 0一Ws.l0AxA。(3)该酶的比活力(R)为:R=5 0一W5.10 xBAx卫&(u/mg)(4式中,1 0为酶解反应时间(mi n);B为样品 管中酶量(mg)。本试验中标准管的淀粉量 亦为5 0mg,所以(4)式可简化为:R=(5/B)(1一Ax/A:)(U/mg)(5)分 光光度法 测定a一淀粉酶活性结果与讨论我们 用上述方 法对赣南酶制剂厂生产的“一淀粉酶 活性进行 了测定,结果见表3。酶量与吸光度(A)的关系见图3表3不 同酶浓度与比活 力的关系试管号酶浓度(%)酶量(B)(mg)比活力(R)(U/mg),人块1人U.n1COJ任,曰Q自,曰2 5。3几J丹b几b.丹O内btl六O内七0 曰今口,曰,曰O n UOC八bJ任今一nO C内bJ皿,匀,曰L11峨1111三0n Unnn日nC U 八UC幼八UonO.10标准管0.200。180。160.140。1 20。100。0 80。0 60。040。020!坐兰里竺巡巨竺鲤U,1。.24;.。210.283.85一,032”690.4,3.36一“4 8“0 30。572。6 60。7 12。0 9,0。8 21。6 4096rl0 71.090.5 30万2云:.1之口奋:.。O。90.8卜一亡JJ性八d沙一1n八曰O自Uco从表3和图3可以看出,酶浓度只有在一定的稀释范围内,酶量 与淀粉降解量才皇直线关系,测 得的比活力才准确。因而在使用本方 法时,首先要进行 初步试验,确定酶的浓度范围。在实验中,我们 注意到温度对碘一淀粉复合物吸光度有影响,如同一种样品在9时,A=2.3 30;而 在1 5时,A=1.2 4 4。因而,本方法 要求每次都需在同一温度下测标准管的吸光度(A:)以保证实验的准确。由于本试验酶解反应 时间 固定为1 0min,这就需要在酶解反应后立即有效地终止酶反应。用加热或加酸可以使某些酶失活。但是有些a一淀粉酶(如IFF lloo8O产生的a一淀粉酶)用加热或加酸的方 法均不能 有效地终止酶解反应。我们 用硫酸铜 溶液和盐酸溶液混今公J奋(幻 1弓图3酶量与吸光度的关 系合作为终止液,结果很佳。加入终止 液后的酶解反应液,在48 h内取样显 色,其吸光 度均稳定不变。上面介绍的方法,用精密光学仪器来定量测定a一淀粉 酶的活性,酶的活力单位以淀粉降解量直接表示,操作简便,结果精确。本方法可用于实验室及工厂检测a一淀粉酶活性。.30.江西科学19 87年第4期参考文献1Street,H.V.andClos e,J.R.Clin。C hem。!、2f3Dahlo uist,Ce ska,M.4 37一4 44。Mar shall,A。:Se and。J。Clin.Lab。Invest.,Aeta,1(19 5 6)256一268.1 4(19 62)145一1 5 1。,Bir ath,K.andBr own,B.:C lin.C hem.Acta,26(1 969)J。J。:C lin.C hem。,2 5(19 79)1 67 5一1 68 0。中华人民共和 国轻工业部部颁标准,QB74 7一8 0(198 1).Ha nse n,p.W.:Anal。Chem.Aeta,155(1954)37 5一3 7 7.、J、.J、l沪月通亡d八br吸尸注尸.七D ETERMI NAT IONO Fa一AMYLASEB YSPECTROPH OT OME T E RTuZoxin,Zho u(InstituteofMier obiologHoshana ndX io 九9Za ny,Jia ngxiAeademyof Seie nees)AB S T R A C TTherelationshipbetwe e ntheabsorbane eA。o,。oftheiodine一sta r ehandtheeonsiste n eeofthestar eh15astraightline。T hestareh15degradedbya一amylaseat3 7fo r10minute,andthedegr adation15stop pedbyad dingCuCI:/H C Ieomplexsolutio n.T hedete rminatio nofa一ar nylase15measur edbytheabsorba neeofiodin e一star ehat5 80nmandtheformula:R=(5/B)(1一Ax/As)。拱狱狱狱报数奈裁狱摧狱报奈狱奈狱奈报奈裁数报条搽获获栽奈数条戮数狱戮数戮戮奈娥奈获狱裁狱撅联条猫条祭撇鞭聚祭奈条聚撇器黔器兴聚撇敬告作者江西科学对来稿有新的要求江西科学为全国公开发行的学术刊物,决 定自19 88年第6卷第1期起 使 用关键词,请广大作 者今后来稿时务必提供3一5个 中英文对应的 关键词,分别列中英文提要之后,关于来稿 的其他要求请参见封三稿约。条报报数条器条条撅条戮条数戮获条条戮条条叛黯撇默黯叛兴黯襄黔聚数奈兴黯叛鞭撇米条茉聚寨兴聚撇兴条黔撇叛叛黯条聚条米戮来柴条兴