柠檬酸对CHO细胞生长和代谢的影响.pdf

华 东 理 工 大 学 学 报(自 然 科 学 版)Journal of East China U niversity of Science and Technology(Natural Science Edition)Vol.32 No.52006205收稿日期:2005206202基金项目:国家863计划(2002AA 2Z344F)作者简介:黄剑峰(19792),男,上海人,硕士,研究方向:生物化学工程。通讯联系人:张立,E2mail:文章编号:100623080(2006)0520556205柠檬酸对CHO细胞生长和代谢的影响黄剑峰,张元兴,张立(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237)摘要:研究了重组中国仓鼠卵巢细胞(CHO)批培养过程中柠檬酸对细胞生长和代谢的影响。结果表明:柠檬酸明显抑制了细胞的生长。与对照组相比,添加12mmol?L柠檬酸的处理组细胞的葡萄糖比消耗速率(QGlc)降低了37.5%,渗透压提高了10.0%,乳酸生成量与葡萄糖消耗量的比值增加了27.0%,氨生成量与谷氨酰胺消耗量的比值也增加了。在谷氨酰胺代谢过程中,更多的谷氨酰胺经谷草转氨酶途径生成 2酮戊二酸,参与能量代谢。柠檬酸促使细胞更多地被捕获在G1期,阻碍细胞的DNA合成,抑制细胞增殖,并促进蛋白的表达。关键词:CHO细胞;柠檬酸;代谢;细胞生长;蛋白表达中图分类号:Q 953文献标识码:AInfluence of Citrate on Growth andM etabolism of CHO CellsH UA N G J ian2f eng,ZH A N G Yuan2x ing,ZH A N G L i(S tate K ey L aboratory of B ioreactor Eng ineering,East China U niversityof S cience and T echnology,S hanghai200237,China)Abstract:The influences of citrate on cell grow th and metabolism were investigated in batch culturesof CHO cells.W ith the addition of citrate,cell grow th is inhibited obviously,while the metabolism ischanged.In batch cultures w ith 12 mmol?L citrate,the specific glucose consumption rate of CHO cells isreduced by 37.5%,and the osmolarity increases by 10.0%,the ratios of lactate accumulation to glucoseconsumption and ammonia accumulation to glutam ine consumption increase,compared to those in themedium w ithout citrate.M ore glutam inewas used for energymetabolism through aspartate am inotransfer2ase pathway.CHO cells could be captured in G1 phase by citrate,which could block DNA synthesis,inhibit cell grow th and induce protein expression.Key words:CHO cells;citrate;metabolism;cell grow th;protein expression柠檬酸是三羧酸循环中重要的中间产物,连接着糖酵解和三羧酸循环,它对糖和脂肪酸代谢有着极为重要的意义。它在糖代谢过程中产生异柠檬酸,抑制磷酸果糖激酶和丙酮酸脱氢酶的活性12。大部分柠檬酸离开三羧酸循环,作为线粒体外乙酰辅酶A合成的碳源3和乙酰辅酶A羧化酶的激活剂45,用于脂肪酸的合成。柠檬酸是能量代谢的产物,当代谢不均衡时,其浓度会明显上升。许多因素都会影响柠檬酸代谢,包括碳源的种类和浓度、氮和磷酸盐浓度、通气状况、微量元素和有机体产物的组成等。细胞的代谢途径主要由细胞株本身的性质及生理状态决定。研究柠檬酸对动物细胞生长及代谢的影响对于培养过程的优化具有重要意义。许多研究认为,使细胞捕获在特定的细胞周期是提高重组细胞蛋白生产的一种有效手段。Jenkins等6通过降低655细胞培养温度,使CHO细胞捕获在G1期而提高了重组蛋白质的生产。W atanabe等7对N SO细胞研究发现,添加IPTG(异丙基22硫代半乳糖苷)后更多的细胞捕获在G1期,使蛋白表达量提高了4倍以上。Carvalhal等8发现,细胞周期依赖性激酶抑制因子p27过量表达时,会明显抑制处于G1期的细胞生长,并使蛋白高效表达。A ggeler等9用同步化的方法研究发现,分泌型溶纤酶原激活剂仅仅在G2?M期表达,而细胞依附型溶纤酶原激活剂大部分表达在G1期和S期。一般认为,外源蛋白质的生产在特定的表达系统中是与特定细胞周期有紧密关系的。本文通过CHO细胞在不同柠檬酸浓度下的培养,研究了不同柠檬酸浓度对细胞生长、代谢及蛋白表达的影响。1材料与方法1.1实验材料细胞为带有外源谷氨酰胺合成酶(Glutam inesynthase,GS)基因,表达外源蛋白的重组CHO细胞。培养基为含有100 g?L新生牛血清(NCS)(杭州四季青生物工程材料有限公司)的DM EM?F12(体积比11)培养基(Sigma,U SA)。1.2细胞培养在75 cm2的方瓶中加入培养基10 mL,细胞接种密度为2.5105cells?mL。所有方瓶置于37C、5%的二氧化碳培养箱中培养。24 h后,取2瓶计数细胞密度,其余分别以不同柠檬酸浓度的培养基换液培养,柠檬酸浓度分别为0、6、12 mmol?L。每天每组各取2瓶计数细胞密度,并收集2 mL上清液置于-20C保存,用于培养基中成分分析。1.3分析方法细胞计数:用血球计数板计数,采用台盼蓝染色法区分活细胞和死细胞10。葡萄糖、氨、乳酸浓度和渗透压的测定葡萄糖和氨的浓度分别采用上海生物制品研究所的葡萄糖和尿素氮试剂盒来定量分析;乳酸采用血清乳酸测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)来分析;渗透压采用冰点渗透压仪(FM28P全自动冰点渗透压计,上海医大仪器厂)测定11。氨基酸浓度的测定:采用邻苯二甲醛(OPA,Fluka,Sw izterland)柱前衍生的反相高效液相色谱分析系统(HPLC,Hew lett2Packard 1100)12。细胞周期分布的测定:采用流式细胞仪进行测定13。抗体浓度的测定:采用EL ISA双抗体夹心法,包括抗体和辣根过氧化物酶标记抗体,均为分析纯化后的多克隆羊抗人IgG抗血清,反应底物为邻苯二胺(OPD),以上试剂购于Sigma公司。2结果与讨论2.1柠檬酸对CHO细胞生长、葡萄糖利用及乳酸生成的影响图1和图2分别为24 h添加6 mmol?L和12mmol?L柠檬酸,分批培养CHO细胞时的细胞生长和葡萄糖的消耗。不添加柠檬酸时,细胞生长的最大活细胞密度明显高于添加柠檬酸时的细胞密度,并且随着柠檬酸浓度的增加,最大活细胞密度相应降低,表明柠檬酸对细胞生长产生了严重的抑制作用,特别是添加12 mmol?L柠檬酸时,96 h后细胞进入衰亡期。从24 h到96 h,添加12 mmol?L柠檬酸处理组 中 葡 萄 糖 浓 度 从17.9 mmol?L降 低 到8.2 mmol?L,而对照组(不添加柠檬酸)葡萄糖浓度降 低 到3.9 mmol?L,总 的 葡 萄 糖 消 耗 降 低 了30.7%。考察24 h到96 h葡萄糖的比消耗速率(QGlc)发 现,添 加 柠 檬 酸 使QGlc从 对 照 组 的4.810-6mmol?(cellsd)降低到处理组的3.010-6mmol?(cellsd),降低了37.5%。总葡萄糖消耗的降低除了部分归因于柠檬酸抑制了细胞的生长外,很重要的原因就是柠檬酸改变了CHO细胞的代谢。图1分批培养时重组CHO细胞在不同柠檬酸浓度培养基中活细胞的生长曲线Fig.1Grow th curve of viable CHO cells in different con2centration of citrate in batch culturec(Citrate)?(mmolL-1):0;6;12图3为柠檬酸对CHO细胞乳酸生成的影响。对照组乳酸在96 h的浓度为10 mmol?L,而处理组(添加12 mmol?L柠檬酸)为9 mmol?L,乳酸生成755第5期黄剑峰,等:柠檬酸对CHO细胞生长和代谢的影响图2分批培养时柠檬酸对CHO细胞葡萄糖代谢的影响Fig.2Effects of citrate on glucose metabolism of CHOcells in batch culturec(Citrate)?(mmolL-1):0;6;12量减少了11就乳酸的比生成速率(QLac)而言,处理组为5.510-6mmol?(celld),对照组为5.210-6mmol?(celld),QLac略有增加。考察24 h到96 h乳酸生成对葡萄糖消耗的得率系数(YLac?Glc)发现,柠 檬 酸 添 加 使 该 参 数 从 对 照 组 的0.74 mmol?mmol上升到处理组的0.94 mmol?mmol,上升了27.0%。这就是说,添加柠檬酸后,单位葡萄糖产生乳酸的量增多了,葡萄糖更多地以低效率的途径产生能量。添加柠檬酸对渗透压的影响见图4,添加12mmol?L柠檬酸后,培养基渗透压提高了10%,但对CHO细胞生长不会产生明显的不良影响14。图3分批培养时柠檬酸对CHO细胞乳酸生成的影响Fig.3Effect of citrate on lactate production in the batchculture of CHO cellsc(Citrate)?(mmolL-1):0;6;122.2柠檬酸对CHO细胞培养中氨的生成和谷氨酰胺代谢的影响图5表示添加柠檬酸对CHO细胞氨产生的影响。在没有添加柠檬酸的对照组中,氨的积累不断上升;在 培 养 结 束 时,氨 的 最 高 浓 度 达 到2.0mmol?L。在处理组中,氨的浓度最高为1.6 mmol?L。图4在不同柠檬酸浓度培养基中分批培养CHO细胞时培养液的渗透压变化Fig.4Effect of citrate on osmolarity in the batch cultureof CHO cellsc(Citrater)?(mmolL-1):0;6;12在24 h到96 h之间,添加12 mmol?L柠檬酸的处理组中氨的比生成速率(QAmm)为1.010-6mmol?(celld),而对照组为0.810-6mmol?(celld)。从氨对谷氨酰胺的得率系数(YAmm?Gln)来看(表1),对照组为1.4 mmol?mmol,处理组为1.6 mmol?mmol。可见,柠檬酸的添加在一定程度上增加了氨的产生。图5分批培养时柠檬酸对CHO细胞氨产生的影响Fig.5Effects of citrate on ammonia production in thebatch culture of CHO cells.c(Citrater)?(mmolL-1):0;6;12表1列出了不同柠檬酸浓度下CHO细胞培养96 h时谷氨酰胺代谢的主要参数。随着柠檬酸浓度的增加,谷氨酰胺的比消耗速率上升,这与柠檬酸刺激谷氨酰胺酶活性的观点相符。谷氨酰胺不仅是细胞主要的氮源物质,而且还是细胞重要的能源物质15。96 h时处理组的细胞密度已停止增加,与对照组相比,谷氨酰胺的比消耗速率(QGln)反而升高;细胞对谷氨酰胺的得率系数(YX?Gln)随着柠檬酸浓度的提高逐渐下降,说明此时更多的谷氨酰胺用于能量代谢等。丙氨酸对谷氨酰胺的得率系数855 华 东 理 工 大 学 学 报(自 然 科 学 版)第32卷表1CHO细胞分批培养96 h时谷氨酰胺代谢的主要参数Table 1Some i mportant parameters of glutam ine metabolism at 96 h in the batch cultures of CHO cellsw ith different citrateconcentrationsc(Citrate)?(mmolL-1)QGln?10-5mmol(cellh)-1YX?Gln?(108cellsmmol-1)YA la?Gln?(mmolmmol-1)YA sp?Gln?(102mmolmmol-1)YAmm?Gln?(mmolmmol-1)02.55.360.773.61.462.74.291.023.91.6122.73.740.974.91.6(YA la?Gln)和氨对谷氨酰胺的得率系数(YAmm?Gln)有所上升,这与上述观点相符。而天冬氨酸对谷氨酰胺的得率系数(YA sp?Gln)明显升高,这说明谷氨酸可能更多地经谷草转氨酶途径生成 2酮戊二酸,参与能量代谢,以保证细胞物质和能量的平衡。3讨论添加柠檬酸后,对CHO细胞生长产生了强烈的抑制作用(图1)。特别是添加12mmol?L柠檬酸这一组,96 h后细胞开始进入衰亡期(比对照组提前了48 h),144 h活细胞密度降至2.4105cells?mL,细胞大量死亡;而此时对照组细胞密度为1.34106cells?mL,刚刚进入衰亡期。从比生长速率来看,96 h对照组为0.36 d-1,而添加12mmol?L柠檬酸的处理组为0.26 d-1,比生长速率下降了27.8%。通过前面对葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸、渗透压和氨的考察发现,添加柠檬酸后,作为细胞生长过程中主要的营养物葡萄糖和谷氨酰胺并没有成为细胞生长的限制性因素,而该条件下代谢副产物乳酸和氨的浓度以及渗透压的大小也不会明显抑制CHO细胞生长14,16。图6为在24 h添加12 mmol?L柠檬酸继续处理72 h后,重组CHO细胞周期分布的流式细胞仪分析图。图中位于55.00左右的黑色尖峰代表细胞周期中的G1期,其积分面积代表了细胞数量分布。阴影区代表了S期,后面较平缓的黑色峰代表了G2期。柠檬酸是脂肪酸合成的重要前体,而添加外源柠檬酸可以提高脂肪酸合成的速率17。脂肪酸的合成首先由乙酰辅酶A开始合成,产物是十六碳的饱和脂肪酸,即软脂酸。软脂酸诱导细胞凋亡的情况也有文献报道1821。然而,从本试验的结果来看,随着柠檬酸浓度的升高,重组CHO细胞并没有出现凋亡现象。但是,柠檬酸对CHO细胞G1和S期分布产生了较为明显的影响。添加柠檬酸使细胞群体中处于G1期的比例明显升高,而处于S期的比例相应降低。在柠檬酸处理48 h后,G1期细胞分布的比例从62.87%上升到74.41%,上升比例为18.36%;S期细胞分布的比例从29.85%下降到18.63%,下降比例为37.59%。S期为DNA合成期,DNA合成是细胞增殖的一个重要标志22。当S期比例明显降低时,更多的细胞捕获在G1期,DNA合成受到抑制,从而抑制细胞扩增8,2324。图6不同柠檬酸浓度下分批培养的CHO细胞流式细胞仪分析图Fig.6Charts of flow cytometer of CHO cells cultured for72 h after changing into medium w ith different cit2rate concentrationsc(Citrate)?(mmolL-1):a0;b12表2为12mmol?L柠檬酸在24 h添加,继续培养72 h后,重组CHO细胞蛋白表达的情况。可见,955第5期黄剑峰,等:柠檬酸对CHO细胞生长和代谢的影响添加柠檬酸对CHO细胞生产蛋白具有明显的刺激作用,重组蛋白的生产量比对照组提高了38%,而重组蛋白的比生产速率也提高了22%。表2添加12mmol?L柠檬酸对CHO细胞蛋白表达的影响Table 2Influence of citrate on the production of proteinc(Citrate)?(mmolL-1)Antibodyconcentrations?(10-8gcell-1)Specific antibodyproduction rates?10-8g(celld)-109.420.113.530.041212.970.034.320.01以上研究结果表明,柠檬酸使细胞周期捕获在G1期,提高了蛋白质的生产量。4结论通过不同柠檬酸浓度的批培养试验,从细胞的生长、营养物和副产物的代谢等方面可以看到,高柠檬酸浓度降低了葡萄糖的消耗,并促进了谷氨酰胺的利用,更多的谷氨酰胺用于能量代谢。柠檬酸对CHO细胞生长的抑制作用较为明显,这是因为柠檬酸促使细胞更多地捕获在G1期,阻碍细胞的DNA合成,抑制细胞增殖并促进重组蛋白的表达。参考文献:1 Bristow J,Bier D M,Lange L G.Regulation of adult andfetalmyocardial phosphofructokinase:Relief of cooperativityand competition between fructose 2,62bisphosphate,ATP,and citrateJ.J Biol Chem,1987,262:217122175.2 Tornheim K,Lowenstein J M.Control of phosphofruc2tokinase from rat skeletalmuscle:Effects of fructose diphos2phate,AM P,ATP,and citrate J.J Biol 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