重组人_干扰素包涵体稀释复性.pdf

研究论文重组人 2干扰素包涵体稀释复性靳 挺 关怡新 费峥峥 姚善泾(浙江大学化学工程与生物工程学系,浙江 杭州310027)摘 要 采用稀释法研究了重组人 2干扰素包涵体复性条件,如温度、pH值、蛋白浓度、复性液中脲浓度,同时对加样操作方式进行了考察,得到了较为适宜的复性条件.结果表明,脲能有效地抑制复性过程中蛋白质的聚集,合适的脲浓度随复性蛋白浓度的增加而有所增大,在4、pH值810、脲浓度110 molL-1、蛋白浓度011 mgml-1及脉冲加样操作方式等条件下,复性后重组人 2干扰素的活性为2139105IUml-1,比活达2121107IUmg-1.关键词 重组人 2干扰素 包涵体 稀释复性中图分类号 Q 511 文献标识码 A文章编号 0438-1157(2004)05-0770-05RENATURATION OF RECOMBINANT HUMANINTERFERON2INCLUSION BODY BY DILUTIONJ IN Ting,GUAN Yixin,FEI Zhengzheng and YAO Shanjing(Department of Chemical and Biochemical Engineering,Zhejiang University,Hangzhou310027,Zhejiang,China)AbstractThe experimental conditions,including temperature,pH,denatured protein concentration and ureaconcentration,in the renaturation process of recombinant human interferon2 inclusion body by dilution werestudied and at the same time pulse renaturation was tested1The optimum renaturation conditions were obtained1Results showed that urea could suppress the aggregation of protein during the renaturation process and thesuitable urea concentration increased with the increase of denatured protein concentration1The activity andspecific bioactivity was up to 2139105IUml-1and 2121107IUmg-1respectively under 4,pH 810,110 molL-1urea,011 mgml-1protein and pulse renaturation operation mode.Keywordsrecombinant human interferon2,inclusion body,renaturation by dilution2003-02-13收到初稿,2003-07-15收到修改稿.联系人:姚善泾.第一作者:靳挺,男,31岁,博士研究生.基金项目:国家自然科学基金(No120076042)及浙江省自然科学基金(No1201099)资助项目.引 言人 2干扰素(IFN2)具有重要的生物学活性,主要表现为抗病毒、抗肿瘤(抑制细胞增殖)和对免疫系统的调节作用等1,由于天然人 2干扰素生产成本高、产量低,难以大规模应用于临床.1982年美国Genetech公司的Gray等2完成了人 2干扰素基因的克隆和在E1coli细胞内的表Received date:2003-02-13.Corresponding author:Prof.YAO Shanjing.E-mail:yaosj che1zju1edu1cnFoundation item:supported by the National Natural Science Foun2dation of China(No120076042)and the Natural Science Foundation ofZhejiang Province(No1201099).达,为人 2干扰素的大规模制备创造了条件.与其他E1coli细胞表达生产的重组蛋白一样,人 2干 第55卷 第5期 化 工 学 报 Vol15552004年5月 JournalofChemicalIndustryandEngineering(China)May2004扰素在E1coli中的表达也会形成不溶的、无活性的包涵体,因此将其转变成有活性的蛋白,即蛋白质复性,是大规模制备人 2干扰素的关键问题之一.通过体外复性将包涵体转变成具有高活性的重组蛋白是目前生产重组蛋白的一个令人关注的问题,已出现了一些复性方法35,如稀释复性、折叠促进剂协助复性、层析复性、分子伴侣复性等,而稀释复性是一种简单快捷的蛋白质复性方法,也是研究其他复性方法的基础.目前有关重组人 2干扰素包涵体复性研究较少,因此本论文将通过培养E1coli基因工程菌,获得富含重组人 2干扰素的包涵体,将包涵体溶解后通过稀释复性法进行人 2干扰素的复性,重点对影响重组人 2干扰素包涵体复性过程的条件进行研究,以期获得较为适宜的复性条件,为后续工作打下基础.1 材料和方法111 实验材料重组人 2干扰素包涵体由浙江大学生物工程研究所制备6.人羊膜传代细胞(WISH)和滤泡性口腔炎病毒(VSV)由浙江大学生物工程研究所保存.营养培基含Eagles最低限度培养基90%,灭活小牛血清10%,青霉素、链霉素各250IUml-1,最后用NaHCO3调pH值至712714.维持液含Eagles最低限度培养基95%,灭活小牛血清5%,其余成分同“营养培基”,此液用于稀释攻击病毒.胰酶混合消化液:1%胰酶(Difco)5 ml,加1%的维尔烯(Versene)溶液2 ml,加无钙镁0101 molL-1PBS(pH值712)至100 ml(其中Difco和Versene的最终含量分别为0105%和0102%).结晶紫染液:结晶紫5 gL-1,NaCl 815gL-1,乙醇500 mlL-1,甲醛30 mlL-1,蒸馏水470 mlL-1.脱色液:乙二醇甲醚50%,蒸馏水50%.其余试剂均购自上海生工生物工程有限公司.112 实验方法11211 包涵体的制备 将发酵所得到的菌体经过50 mmolL-1Tris2HCl(pH值810,含1 mmolL-1EDTA)清洗后,重新悬浮于上述缓冲液中,冰浴超声波破碎.超声3 s,间隔5 s,功率400W,150次,然后经8000 rmin-1离心15 min,弃去上清液,即得人 2干扰素包涵体粗品.11212 包涵体的洗涤 将人 2干扰素包涵体粗品加入到50 mmolL-1Tris2HCl(pH值810)配制的015%Triton X2100洗涤液中,于磁力搅拌器上洗涤2 h.8000 rmin-1离心15 min,弃去上清液,取沉淀.11213 包涵体的裂解 将洗涤后的包涵体,加入到50 mmolL-1Tris2HCl(pH值810,含7 molL-1盐酸胍、1 mmolL-1EDTA、10 mmolL-1DTT)配制的裂解液中,于磁力搅拌器上搅拌过夜.然后经10000 rmin-1离心30 min,取上清液,即得人 2干扰素包涵体裂解液.11214 包涵体的稀释复性 将一定量的包涵体裂解液加入到复性缓冲液50 mmolL-1Tris2HCl(pH值810),含0115 molL-1NaCl、1 mmolL-1EDTA和一定浓度的脲中,复性24 h,然后装入透析袋放于冰箱中,对50 mmolL-1Tris2HCl(pH值810)充分透析.透析后,样品经8000 rmin-1离心15 min,收集上清液,测定蛋白浓度和活性.113 分析方法11311 蛋白浓度测定 考马斯亮蓝法7,以牛血清白蛋白为标准品.11312 人 2干扰素活性测定 细胞致病效应抑制(CPE)法8.将IFN2 标本用营养培基进行4倍递次稀释,稀释56个梯度,每个梯度需做34次重复.消化预先培养好的WISH细胞单层,用营养培基制成约每毫升30万个细胞的悬液,向96孔细胞板上每孔加入100l细胞悬液.23 h后细胞基本贴壁,每孔加入IFN2 标本100l,细胞对照孔和病毒对照孔加入100l营养培基.置CO2孵育箱中培养过夜,弃上清液,向每孔中加入100l VSV攻击(约200 TCID50ml-1),细胞对照孔加100l维持液,置CO2培养箱37 孵育,直到病毒对照孔达100%攻击(约2430 h).弃上清液,每孔加入40l结晶紫染液,室温下染色30 min.用流动自来水轻轻冲洗掉残留染料,将微板中水吸干,向每孔中加入100l脱色液脱色1 h,用酶标仪在540 nm波长处测定OD值,按“Reed2Muench”法计算IFN2 效价.2 结果与讨论177 第55卷 第5期 靳挺等:重组人 2干扰素包涵体稀释复性211 重组人 2干扰素包涵体变性蛋白浓度对复性的影响 将重组人 2干扰素包涵体变性蛋白(初始蛋白浓度10 mgml-1)进行稀释复性,复性缓冲液中最终蛋白浓度分别为:0105、011、012、014、016 mgml-1和110 mgml-1,体系中的脲浓度2molL-1,不同蛋白浓度对复性的影响结果示于图1.Fig11Effect of protein concentrationon renaturation of IFN2(renaturation buffer containing 0115 molL-1NaCl,1 mmolL-1EDTA and 2 molL-1urea,25)如图1所示,随着蛋白浓度的增加,复性后人 2干扰素的活性呈明显的下降趋势.蛋白浓度为0105 mgml-1时,复性后人 2干扰素的活性是蛋白浓度为110 mgml-1时复性样品活性的11倍.由此可见,人 2干扰素包涵体变性蛋白的终浓度越低,越有利于 2干扰素的复性.对于稀释复性而言,蛋白浓度对复性有着重要影响.这主要是由于在复性时,蛋白质的中间态分子有大量的疏水氨基酸残基存在,随着蛋白浓度增高,分子间作用力加大,使蛋白质分子间聚合趋向增大,相互结合形成寡聚体和多聚体,这些寡聚体和多聚体再进一步结合形成沉淀9.但蛋白浓度也不宜过低,因为初始蛋白浓度过低,则复性后蛋白浓度更低,造成活性蛋白难于回收,给后处理带来不便.蛋白浓度一般在0105011mgml-1为宜.212 脲浓度对重组人 2干扰素包涵体复性的影响将重组人 2干扰素包涵体变性蛋白进行稀释复性,复性缓冲液中最终蛋白浓度分别为011 mgml-1和110 mgml-1,向复性缓冲液中添加不同浓度的脲对复性的影响结果示于图2.从图2可知,当蛋白浓度为011 mgml-1、复性液中脲浓度为015115 molL-1时,或当蛋白浓度为110 mgml-1、复性液中脲浓度为215310 molL-1时,复性后的人 2干扰素具有较高的活性.Fig12Effect of urea concentration onrenaturation of IFN2(renaturation buffer containing 0115 molL-1NaCl,1 mmolL-1EDTA and urea,25)采用向复性液中加入低浓度脲的方法,可以提高复性的收率10.对于不同蛋白浓度,所需的合适脲浓度也不同.低于合适浓度,脲不能最大程度地抑制蛋白中间态分子的聚集;而高于合适浓度,过量的脲又会抑制蛋白质中间态分子的正常折叠复性,造成复性收率降低.对本实验而言,当初始蛋白浓度为011 mgml-1时,合适的脲浓 度 为015115 molL-1;当初始蛋白浓度为110 mgml-1时,合适的脲浓度为215310 moll-1.因此,有效抑制蛋白质聚集的合适脲浓度与变性蛋白的复性底物浓度密切相关,合适脲浓度随复性底物蛋白浓度的增加而有所增大.213 温度和pH值对重组人 2干扰素包涵体复性的影响 温度对重组人 2干扰素包涵体变性蛋白复性的影响结果示于图3.从图3可知,在4 复性的人 2干扰素的活性高于在25 复性的样品,并且随着变性蛋白浓度的增加,二者在活性上的差距越来越大.这是由于人 2干扰素包涵体变性蛋白在折叠过程中,分子内的疏水基团暴露在溶液中,使多肽链的疏水基团之间相互作用、碰撞,形成不正确的折叠而导致聚集.随着复性温度的升高,疏水作用力增强,使蛋白质正确折叠的主要竞争者 聚集体也更容易形成,造成活性收率的降低.pH值对重组人 2干扰素包涵体变性蛋白复性的影响结果示于图4.从图4可知,在pH值277化 工 学 报 2004年5月 Fig13Effect of temperature on renaturation of IFN2(renaturation buffer containing 0115 molL-1NaCl,1 mmolL-1EDTA and 2 molL-1urea)710810时,人 2干扰素活性明显高于pH值为815910时的样品,可能的原因如下.人 2干扰素在碱性pH值条件下容易失活.当pH值为815910时,虽然包涵体可以发生折叠,但折叠后的人 2干扰素处于这种不利于保持其活性的环境中,很容易丧失活性.人 2干扰素作为一种细胞因子,发挥其活性作用的pH值有严格的范围,超出这个范围,其活性作用就会迅速减弱.人 2干扰素的等电点为pH值815910,当蛋白质处于等电点pH值时,蛋白质的净电荷为零,由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于结聚而沉淀,因此蛋白质的溶解度达到最低点,所以选择pH值应避免在蛋白质等电点处进行复性11.由此可见,人 2干扰素包涵体变性蛋白复性宜在pH值710810之间进行.Fig14Effect of pH on renaturation of IFN2(renaturation buffer containing 0115 molL-1NaCl,1 mmolL-1EDTA and 2 molL-1urea,25)214 脉冲加样对重组人 2干扰素包涵体复性的影响 采用脉冲加样方式(pulse renaturation),即分3次加入人 2干扰素包涵体变性液,每次间隔2 h,对复性的影响结果示于图5.从图5可知,与一次性直接稀释复性法相比,采用脉冲加样操作方式可以获得更高的活性.这与Rudolph等10,12的研究结果相一致.Fig15Effect of pulse renaturation onrenaturation of IFN2(renaturation buffer containing 0115 molL-1NaCl,1 mmolL-1EDTA and 2 molL-1urea,25)稀释复性操作的关键是控制变性蛋白加入复性液的速率和混合完全以维持低的蛋白浓度而阻止其聚集13.在复性过程中,蛋白质浓度对复性结果有重要影响.分批加入人 2干扰素包涵体变性蛋白,相当于降低了变性蛋白的初始浓度,由于已具有正确构象的蛋白质并不参与导致蛋白质复性收率下降的最主要的过程 蛋白质聚集,因此根据蛋白质复性是逐渐恢复其正确构象的特点,采用脉冲加样操作方式向复性液中加入变性蛋白,可以提高复性收率.3 结 论本研究对 2干扰素包涵体稀释复性的条件做了较详细的研究.脲能有效地抑制复性过程中蛋白质的聚集,合适的脲浓度随复性蛋白浓度的增加而有所增大,蛋白浓度为011 mgml-1时,合适的脲浓度为015115 molL-1;蛋白浓 度 为110mgml-1时,合适的脲浓度为215310 molL-1.在4、pH值810、脲浓度110 molL-1、蛋白浓度011 mgml-1及脉冲加样操作方式等条件下,复性后重组人 2干扰素的活性为2139105IUml-1,比活达2121107IUmg-1.References1Pestka S,Langers A J,Zoon C K,Samuel C E1Interferons andTheir Actions.Ann1Rev1Biochem1,1987,56:7277772Gray P W,Leung D W,Pennica D,Yelverton E,Najarian R,Simonsen C C,Derynck R,Sherwood PJ,Wallace D M,Berger SL,Levinson A D,Goeddel D V1Expression of Human Immune377 第55卷 第5期 靳挺等:重组人 2干扰素包涵体稀释复性Interferon cDNA inE1coliand Monkey Cells.Nature,1982,295:5035083Gao Yonggui(高永贵),Guan Yixin(关怡新),Yao Shanjing(姚善泾).Refolding of Genetic Engineering Protein Expressed asInclusion Bodies.Bulletin of Science and Technology(科技通报),2003,19(1):10154Gao Yonggui,Guan Yixin,Yao Shanjing,Cho Mangi.Refoldingof Lysozyme atHigh Concentration in Batch andFed2batchOperation.Korean J1of Chem1Eng1,2002,19(5):8718755Gao Yonggui,Guan Yixin,Yao Shanjing,Cho Mangi.LysozymeRefolding at High Concentration by Dilution and Size2exclusionChromatography.Journal ofZhejiang University(Science),2003,4(2):1361416Jin Ting(靳挺),Guan Yixin(关怡新),Yao Shanjing(姚善泾).Research on 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