第6章- 高效毛细管电泳.pdf

19371937年，瑞典科学家蒂塞利乌斯年，瑞典科学家蒂塞利乌斯（TiseliusTiselius）设计了世界上第一台电）设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法，用于牛血清中分离血清蛋白、-、-和-球蛋白，并于19481948年荣获诺贝尔化学奖。多年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：1、提高分辨率及灵敏度。2、简化操作，缩短电泳时间。3、扩大应用范围。各类电泳技术已广泛应用于生命科学 毛细管电泳(CE)又称高效毛细管电泳(HPCE)，是指离子或带电粒子以毛细管为分离介质，以高压直电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的液相分离分析技术。采用了0.05 mm内径的毛细管；采用了高达数千伏的电压。4毛细管电泳：毛细管电泳(CE)又称高效毛细管电泳(HPCE)，是指离子或带电粒子以毛细管为分离室,以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度上的差异而实现分离的液相分离分析技术。由于毛细管内径小，表面积和体积的比值大，易于散热，因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生，这是CE和传统电泳技术的根本区别。传统电泳：受到焦耳热的限制，只能在低电场强度下进行电泳操作，分离时间长，效率低。传统电泳与毛细管电泳的区别：5同：均为液相分离分析方法。同：均为液相分离分析方法。可用相同的理论来描述（差速迁移），一些色谱名词概念，如：可用相同的理论来描述（差速迁移），一些色谱名词概念，如：塔板理论、速率理论、保留值等仍可使用。塔板理论、速率理论、保留值等仍可使用。异：分离原理不同；异：分离原理不同；仪器构造有很大的差异。仪器构造有很大的差异。HPLC示意图CE示意图61 1、毛 细 管 电 泳 柱 效 更 高毛 细 管 电 泳 柱 效 更 高，塔 板 数 可 达塔 板 数 可 达10105 5 10106 6/m/m，（又称高效毛细管电泳又称高效毛细管电泳，HPCEHPCE）；2 2、分离速度更快；分离速度更快；3 3、溶剂溶剂、试样消耗极少试样消耗极少，（纳升级纳升级）；4 4、仪器成本低仪器成本低，（不需要高压泵不需要高压泵）；5 5、选择性高选择性高。通过选择操作模式和缓冲溶液的成通过选择操作模式和缓冲溶液的成分以达到对性质不同的成分的有效分离分以达到对性质不同的成分的有效分离。6 6、应用广泛应用广泛。特别适用于氨基酸特别适用于氨基酸、多肽多肽、蛋白质蛋白质和核酸等生命科学领域的测定和核酸等生命科学领域的测定，以后逐渐被广泛应用以后逐渐被广泛应用于生物于生物，化学化学，医药医药，环保等领域环保等领域。与与HPLCHPLC互相补充互相补充，共同成为分析化学中重要的分离分析技术共同成为分析化学中重要的分离分析技术。三、毛细管电泳三、毛细管电泳的特点和分类的特点和分类（一）毛细管电泳的特点7（二）毛细管电泳的分类按毛细管中填充物的性质分类：自由溶液毛细管内填充物为pH缓冲的电解质溶液。如：毛细管区带电泳（CZE）。非自由溶液毛细管内填充物为凝胶或其他筛分介质。如：毛细管凝胶电泳（CGE）。按分理机制分类：电泳型:CZE、CGE、NACE（非水）色谱型:胶束电动毛细管色谱（MECC）微乳液电动毛细管色谱（MEECC）电泳/色谱型:毛细管电色谱（CEC）（一）基本概念毛细管总长度(L,cm)L,cm)毛细管有效长度(l,cm)l,cm)毛细管的入口端到检测窗口毛细管的入口端到检测窗口的距离；的距离；迁移时间(t,min)t,min)带电粒子在电场作用下做定向移动带电粒子在电场作用下做定向移动的时间；的时间；电泳速度（v cm/sv cm/s）在单位时间内，带电粒子定向在单位时间内，带电粒子定向移动的距离；移动的距离；电场强度(E,V/cm)E,V/cm)电场强度电场强度/毛细管总长度；毛细管总长度；电泳淌度（cm2/(Vs)）带电粒子在毛细管中定向移动的速度与所在电场强度之比；9一、电泳和电泳淌度（mobility）电泳速度（uepcm/s）：在单位时间内，带电粒子在毛细管中定向移动的距离。电泳淌度（epcm2/(V.s)）：带电粒子在毛细管中，单位电场强度下、单位时间内定向移动的距离。LVEuepepep 电泳：在电场作用下，带电粒子在缓冲溶液中的定向移动。或：单位电场强度下的电泳速度。E电场强度；L：毛细管长度；V：毛细管两端施加电压104iep :粒子的Zeta电势；与粒子表面的电荷密度有关，近似正比于Z/M2/3；:介质的粘度。:介质的介电常数；电泳淌度11epiiieff 有效淌度eff、有效电泳速度ueff：考虑实际溶液中，溶质分子的离解程度，离子的活度系数对离子淌度的影响。溶质分子的i级离解度；i i 综上所述：荷电粒子在电场中的迁移速度，除与电场强度和介质特性有关外，还与粒子离解度、电荷数以及粒子的大小和形状有关。离子的活度系数。Eueffeff 当固体与液体接触时，固体表面带一种电荷，因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层。当液体两端施加电压时，就会发当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，生液体相对于固体表面的移动，这种现象叫这种现象叫电渗现象电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流电渗流（electroosmotic flow，简，简称称EOF）。）。石英毛细管柱，内充液pH 3时，表面电离成-SiO-，管内壁带负电荷，形成双电层后，电渗流方向为由正极到负极。电渗流形状：平头塞状SiO在电场中，液体相对毛细管内壁的移动均为向负极方向的移动，电渗速度是电泳速度的57倍，因此无论是正离子、负离子还是中性分子，都将随着电渗流朝着一个方向移动。电渗与电泳作用的对象不同:电泳荷电粒子电渗溶液（缓冲溶液，pH2）电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的57倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：+=电渗流+ef 阳离子运动方向与电渗流一致；-=电渗流-ef 阴离子运动方向与电渗流相反；0=电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在在HPCEHPCE中，控制电渗流非常重要。中，控制电渗流非常重要。1.电场强度的影响电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。2.毛细管材料的影响不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；（1 1）溶液）溶液pHpH的影响的影响对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7pH=7，达到最大；达到最大；pH3pH300m。423.未涂渍柱首次使用前的预处理1mol/L NaOH水运行缓冲液515倍柱体积515倍柱体积35倍柱体积依次冲洗柱长选择：虽然增加柱长可以增加理论塔板数（电场强度须保持恒定），但是柱长增加将会降低电场强度的稳定性，解决办法是增加操作电压。操作电压焦耳热所以，70cm为阈值，常用30cm左右（区带电泳）。但是:43三、进样1.电动进样当把毛细管的进样端插入试样溶液中并加上电场E时，组分会因电迁移或电渗作用而进入管内。优点：对毛细管的填充介质没有特别限制；可实现自动化进样。缺点：对离子组分存在进样偏向。uap大者，进多；小者进少或不进。如此，降低了分析的准确性、可靠性和重现性。442.压力进样（流动进样）当将毛细管的两端置于不同的压力环境时，管中溶液既能流动，将样品带入。优点：没有组分偏向问题，进样量与试样基质无关。缺点：选择性差，组分与基质都同时被引进管中，对后续的分离产生影响（增加难度）。条件：毛细管填充物必须具有流动性。453.扩散进样利用浓度差扩散原理将试样分子引入毛细管。优点：对管内介质没有任何限制，属普适性进样方法；由于扩散的双向性，在溶质进入毛细管内的同时，区带中的背景物也向管外扩散，如此可抑制背景，提高分离效率；扩散与迁移速度和方向无关，因此无进样偏向。缺点：进样动力属不可控参数，进样量仅由扩散时间控制，需精密控制时间。46四、检测面临的问题：由于毛细管内径极小，如何解决灵敏度的问题？由于毛细管内径极小，如何解决谱带展宽的问题？如果按照常规的色谱检测器的设计思路，死体积太大。解决办法：柱上检测。常用检测器：紫外检测器 激光诱导荧光（LIF）检测器47 紫外检测器图20-5 球镜聚焦增强紫外检测灵敏度球镜聚焦：1.检测窗口2.毛细管3.基座4.调焦机构5.圆形狭缝6.狭缝7.球透镜48 激光诱导荧光检测器毛细管水柱单色仪PMTHg-Xe激光器L1L2L3L4L5L1L5透镜，F 滤光片F49激光诱导荧光检测器的特点：灵敏度极高，一般检测限为10-1010-12mol/L，比UV低56个数量级。