动物源性食品中磺胺类药物残留量LC-MSMS分析方法.pdf

51一、背景磺胺类药物（Sulfonamides，SAs）是指一类具有对氨基苯磺酰胺结构、用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学药物，是当前畜禽生产中常用的抗菌、抗原虫药物，具有抗菌谱广、价格低、化学性质稳定、使用方便等优点。但是摄入大量磺胺类药物会破坏正常免疫机能，破坏人的造血系统，造成溶血性贫血症、粒血细胞缺乏症等症状。并且人体长期摄入含磺胺类药物的动物性食品后，药物不断在人体内蓄积，当积累到一定程度后，就会对人体产生毒性作用，同样可引起肾损害，所以针对磺胺类药物的监控是一项刻不容缓的工作。目前关于磺胺类药物的标准已出台GB/T 20759-2006 畜禽肉中十六种磺胺类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法、GB/T 21316-2007动物源性食品中磺胺类药物残留量的测定 高效液相色谱-质谱-质谱法，方法中涉及肌肉、内脏、鱼、虾和肠衣、牛奶中磺胺脒、甲氧苄啶、磺胺醋酰、磺胺嘧啶等几十种磺胺类药物的前处理方法及液质检测方法。本文中将详细介绍采用AB SCIEX API 4000 LC-MS/MS检测磺胺类药物分析10种磺胺类药物，并且经实验证实AB SCIEX API 4000+、4000 QTRAP、API 5000以及TRIPLE QUAD 5500、QTRAP 5500同样适用与该方法。二、化合物信息动物源性食品中磺胺类药物残留量LC-MS/MS分析方法表1.化合物基本信息化合物 英文通用名 分子量 CAS 分子式磺胺嘧啶 Sulfadiazine 250.3 68-35-9 C10H10N4O2S磺胺吡啶 Sulfapyridine 249.3 144-83-2 C11H11N3O2S磺胺噻唑 Sulfathiazole 255.3 72-14-0 C9H9N3O2S2磺胺甲基嘧啶 Sulfamerazine 264.3 127-79-7 C11H12N4O2S磺胺二甲嘧啶 Sulfadimidine 278.3 57-68-1 C12H14N4O2S磺胺甲氧哒嗪 Sulfamethoxypyridazine 280.3 80-35-3 C11H12N4O3S磺胺间二甲氧嘧啶 Sulfadimethoxine 310.3 155-91-9 C12H14N4O4S磺胺氯达嗪 Sulfachlorpyridazine 284.7 80-32-0 C10H9ClN4O2S磺胺邻二甲氧嘧啶 Sulfadoxine 310.3 2447-57-6 C12H14N4O4S磺胺甲基异恶唑 sulfamethoxazole 253.3 723-46-6 C10H11N3O3S磺胺苯吡唑 Sulfaphonazole 314.4 526-08-9 C15H14N4O2S三、前处理方法（GB/T21311-2007）3.1提取3.1.1 肌肉、内脏、鱼虾和肠衣称取2 g（精确至0.01 g）试样置于玻璃研钵内，再称取约6 g（精确至0.01 g）C18填料加至试样上用玻璃杵轻轻研磨，使样品与填料混合均匀（色泽均一，状态分散），装于50 mL具螺旋盖聚四氟乙烯离心管中，加入25 mL乙腈-水溶液，涡旋振荡1 min，放入家用微波炉中在光波模式下微波辐照30 s，3000 r/min离心5 min，将乙腈层移入100 mL棕色分液漏斗中。离心后的沉淀物再加入25 mL乙腈摇匀，微波辅助提取30 s，3000 r/min离心5 min，合并已经提取液，待净化。动物源性食品中磺胺类药物残留量LC-MS/MS分析方法523.1.2 牛奶称取2 g（精确至0.01 g试样置于玻璃研钵内，加入6 g（精确至0.01 g）硅藻土，另加入6 g（精确至0.01 g）C18填料，用玻璃杵轻轻研磨30 s，使样品与填料混合均匀（色泽均一，状态分散），装于50 mL具螺旋盖聚四氟乙烯离心管中，加入25 mL乙腈-水溶液，涡旋振荡1 min，放入家用微波炉中在光波模式下微波辐照30 s，3000 r/min离心5 min，将乙腈层移入100 mL棕色分液漏斗中。离心后的沉淀物再加入25 mL乙腈摇匀，微波辅助提取30 s，3000 r/min离心5 min，合并已经提取液，待净化。3.2净化提取液中加入25 mL乙腈饱和正己烷溶液，振摇5 min，将底层乙腈溶液移入150 mL棕色鸡心瓶中，加入10 mL正丙醇，用旋转蒸发仪于45水浴中加压蒸发至近干，氮气流吹干，准确加入1 mL乙腈-水溶液，超声30 s溶解残渣，将溶解液移入10 mL棕色离心管中，加入0.5 mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡2 min，于3000 r/min离心5 min，弃去正己烷溶液，取底层乙腈-水溶液过0.22 m微孔滤膜后，供高效液相色谱-质谱/质谱测定。四、实验方法4.1液相条件色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18,3.0100mm,3.5 m；柱温：40，流速：300 L/min；流动相：A：水（含1mM甲酸铵及0.1%甲酸），B：乙腈；梯度洗脱，洗脱条件见表2：表2.液相色谱条件时间（min）流速（L/min）A（%）B（%）0 300 90 10 2.5 300 10 90 4.8 300 10 90 4.9 300 90 10 10 300 90 104.2质谱条件离子源：Turbo V 离子源；扫描模式：正离子；采集模式：多反应监测MRM；表3.磺胺类药物代谢物MRM离子对化合物名称 母离子 定量子离子 定性子离子 扫描模式磺胺氯哒嗪 285 156 108 正离子磺胺嘧啶 251 156 108 正离子磺胺甲基异恶唑 254 156 108 正离子磺胺噻唑 256 156 108 正离子磺胺甲基嘧啶 265 156 172 正离子53动物源性食品中磺胺类药物残留量LC-MS/MS分析方法磺胺邻二甲氧嘧啶 311 156 108 正离子磺胺吡啶 250 156 184 正离子磺胺甲氧哒秦 281 156 108 正离子磺胺二甲嘧啶 279 124 186 正离子磺胺苯吡唑 315 156 222 正离子磺胺间二甲氧嘧啶 311 156 108 正离子五、定量质谱数据5.1化合物保留时间及灵敏度表4.各化合物色谱图中保留时间及对应浓度信噪比化合物名称 检测离子对（m/z）保留时间（min）浓度（ng/mL）信噪比*磺胺氯哒嗪 285/156 4.00 0.001 6.3磺胺嘧啶 251/156 3.57 0.002 12.9磺胺甲基异恶唑 254/156 4.07 0.001 5.9磺胺噻唑 256/156 3.58 0.001 12.6磺胺甲基嘧啶 265/156 3.75 0.001 12.8磺胺邻二甲氧嘧啶 311/156 4.07 0.001 53.1磺胺吡啶 250/156 3.68 0.001 19.5磺胺甲氧哒嗪 281/156 3.92 0.001 13.8磺胺二甲嘧啶 279/186 3.87 0.001 14.9磺胺苯吡唑 315/158 4.24 0.001 13.6磺胺间二甲氧嘧啶 311/156 4.23 0.001 75.4*：信噪比按照3倍标准偏差计算。图1.磺胺类药物色谱峰54在标准GB/T 21316-2007动物源性食品中磺胺类药物残留量的测定 高效液相色谱-质谱-质谱法中规定该方法磺胺类药物的最低残留量为10 g/kg，在本实验中完全能够满足检测要求。5.2重现性数据 图2.化合物灵敏度及对应空白色谱图图3.添加基质样品连续采集7针得到对应峰面积图3中以磺胺氯达嗪为例，添加基质样品在方法LOQ浓度下连续采集7次，得到方法相对标准偏差CV%。图4中以部分化合物为例，列举磺胺类药物检测方法的标准偏差。可以看到化合物的CV%均小于5%，满足方法中“在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%”要求。55图4.连续7针得到的相对标准偏差六、结论6.1 采用AB SCIEX API 4000灵敏度完全可满足磺胺类药物在动物源性食品安全法规要求；6.2 AB SCIEX API 4000可精确定量分析，特别是在分析复杂基质样品中磺胺类药物时，实验结果可看到低浓度同样具有良好的重现性以及准确性；动物源性食品中磺胺类药物残留量LC-MS/MS分析方法