鱼源抗氧化肽的结构与其功能关系研究进展_左依瑾.pdf

左依瑾，于子淇，申雪晴，等.鱼源抗氧化肽的结构与其功能关系研究进展 J.食品工业科技，2023，44（14）：419429.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022080200ZUO Yijin,YU Ziqi,SHEN Xueqing,et al.Recent Advance on the Structure-Activity Relationship in Antioxidant Peptides of FishJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(14):419429.(in Chinese with English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022080200 专题综述 鱼源抗氧化肽的结构与其功能关系研究进展鱼源抗氧化肽的结构与其功能关系研究进展左依瑾1，于子淇1，申雪晴1，周慧1,2，李想1,2，蔡一镝1,2，武龙1,2,*（1.大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁大连 116023；2.海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，大连工业大学，辽宁大连 116034）摘要：氧化反应不仅与许多慢性疾病相关，同时亦是食品酸败的诱因之一，能够降低食品营养价值并缩短货架期。近年来，具有抗氧化活性的肽氨基酸组成、排列顺序及空间构象已被广泛报道。随着相关研究的不断深入，肽的构效关系已逐步成为阐明其抗氧化机制的核心问题。当前研究中，从陆地动物中分离的抗氧化肽，其抗氧化作用机制已基本明晰。然而，针对蛋白质含量的更高的鱼类资源，其抗氧化肽的构效关系研究甚少。因此，本文基于抗氧化肽电子转移清除自由基、氢原子转移清除自由基和螯合促氧化金属离子的作用机制，对鱼类源抗氧化肽的一级结构和二级结构对活性产生的重要影响进行综述。重点分析含硫氨基酸、芳香族氨基酸、部分疏水性氨基酸和部分中性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸对抗氧化活性的影响，以期指导抗氧化肽相关食品的研发，深度拓展抗氧化肽产品的消费市场。关键词：鱼类，酶解，抗氧化肽，构效关系，作用机制本文网刊:中图分类号：TS209 文献标识码：A 文章编号：10020306（2023）14041911DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022080200RecentAdvanceontheStructure-ActivityRelationshipinAntioxidantPeptidesofFishZUOYijin1，YUZiqi1，SHENXueqing1，ZHOUHui1,2，LIXiang1,2，CAIYidi1,2，WULong1,2,*（1.College of Food Science and Engineering,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China；2.Collaborative Innovation Center of Seafood Deep Processing,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China）Abstract：Oxidation reaction in food is related to chronic diseases and rancidity,shortening the nutritional value and shelflife of products.In recent advances,the amino acid,sort order and spatial conformation of the antioxidant peptides is wildlyreported.The structure-function relationship of antioxidant peptides has become the main factors on the determination ofthe antioxidant mechanisms.However,compared with the significant antioxidant effect of the peptides from land animals,such structure-function relationship of the antioxidant peptides in the fish,which is rich in proteins,is seldom reported.Therefore,antioxidant mechanisms of the peptides from fish,such as scavenging the intracellular reactive oxygen species invivo,scavenging the free radicals in vitro and chelating the pro-oxidant metal ions is summarized in this review.Thestructure-function relationship between the primary structure and secondary structure on the antioxidant activity of fishpeptides is provided.Moreover,the effects of non-polar amino acids,polar uncharged amino acids,polar positively chargedamino acids and polar negatively charged amino acids are further reviewed.The review would provide a guide for theapplication of antioxidant peptides,and expand the food market for such products.Keywords：fish；enzymolysis；antioxidant peptides；structure-effect relationship；effect mechanism 活性氧（reactive oxygen species，ROS）在有氧生物的新陈代谢和呼吸过程中自然产生1，当自由基产生过多或产生后没有被完全清除时，它们可以攻击附近的分子，使其失去电子，缺少电子的分子会攻击其 收稿日期：20220819 基金项目：“蓝色粮仓科技创新”国家重点研发计划项目（2019YFD0901800）；现代农业产业技术体系藻类产业技术体系（CARS-50）。作者简介：左依瑾（1998），女，硕士研究生，研究方向：食品科学，E-mail：。*通信作者：武龙（1976），男，博士，研究方向：生物资源利用，E-mail：。第 44 卷 第 14 期食品工业科技Vol.44 No.142023 年 7 月Science and Technology of Food IndustryJul.2023 他分子，造成氧化损伤2。目前，天然或合成抗氧化肽35可以作为外源性抗氧化剂维持体内或油脂的氧化还原平衡、预防和治疗疾病。因它们比酶类抗氧化剂结构简单，更稳定，不会产生危险的免疫反应，从而备受青睐6。利用自然资源筛选和获得具有明确结构的抗氧化效用的肽产品正在成为食品和医疗行业的动力。2021 年我国鱼类总产量超过 3561 万吨，占水产品总产量的 1/2 以上7，鱼类加工过程中产生了约占鱼体50%70%的副产物8，包括：头、皮肤、骨骼、鳞片、鳍和内脏等9。鱼蛋白是一种极佳的抗氧化肽来源，与微藻、鸡蛋、大豆等原料蛋白相比，鱼类蛋白富含Arg、Lys 和 Gly，从鱼的不同部位制备的水解液可以作为必需氨基酸的良好来源，且其容易被人体吸收10。因此，与其他蛋白资源相比，鱼蛋白具有不同的氨基酸的种类和水平10，这为制备出不同结构的抗氧化肽带来更多的可能性。近年来，针对抗氧化肽制备、分离纯化和鉴定序列方面的研究较多，当前研究人员主要通过酶解或发酵11生产，并且可以与超声波12、微波13、高压脉冲电场14和超临界水萃取14等预处理技术结合，以获得更高的产量和投入更低的成本。当前关于抗氧化肽活性位点、结构特征与功能方面有一定的显示报道，但其构效关系与作用机制仍处于探索阶段。一直以来，氨基酸类型和序列被认为是决定肽的抗氧化性能的重要因素15。蛋白质中存在的 20 种氨基酸可以与自由基反应，表 1 罗列了近年来的鱼类抗氧化肽的作用机制，说明了氨基酸的结构特性与抗氧化能力的关系。此外，抗氧化肽的相互作用和二级结构影响抗氧化肽活性的高低，协同作用能增强整体抗氧化肽的活性，拮抗作用会减弱整体抗氧化肽的作用16。不论是一级结构的相互作用17，还是混合肽之间的相互作用，都会影响肽作为抗氧化剂的能力强弱16。水解及预处理手段会使有序结构和无序结构二者发生转换，结果是造成了肽的二级结构含量与肽的活性成正相关或负相关。因没有一种单一的检测方法能反映抗氧化肽所有的作用机制，其机理包括通过清除自由基、抑制脂质氧化和螯合金属离子、提高氧化防御蛋白和酶的表达等18。抗氧化过程中，肽的特殊基团贡献电子与 ROS 反应，或者由氨基酸提供氢原子，致使氢原子的位置和峰值发生变化，最终清除自由基11,1920。图 1 反映了各个氨基酸的抗氧化机制，含硫氨基酸和疏水性氨基酸的抗氧化机制都包括 a、b 和 d，芳香族氨基酸的抗氧化机制包括 a 和 b，部分中性氨基酸的抗氧化机制包括 a，碱性氨基酸包括 a、b 和 c，酸性氨基酸包括 a 和 c。本文综述了国内外鱼类及其副产物蛋白抗氧化肽的结构对自由基和金属离子的影响，重点梳理总结了抗氧化肽的关键作用位点和官能团对其作用机制的影响，以期对体外合成高活性抗氧化肽指出新的发展方向和提高副产物利用价值。1一级结构与清除自由基能力的关系 1.1含硫氨基酸Met 和 Cys 是侧链拥有巯基（sulfhydryl group，-SH）的氨基酸，-SH 的暴露可以增强肽清除自由基的能力21。Met 是一种高度疏水的氨基酸，其抗氧化机制既包括图 1 中的 b 和 d 途径。鲈鱼蛋白肽 GGGAGMLLK（Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Met-Leu-Leu-Lys）序列中的 Met 结构的 S 原子可以提供电子从而被氧化成 Met 亚砜22，Met 因具有共振结构而能维持抗氧化的稳定性22。安康鱼肌肉蛋白肽 LMGQW（Leu-Met-Gly-Gln-Trp）的氧自由基吸收能力（Oxygen radi-cal absorbance ability，ORAC）都高于 GSH，序列中的 Met 是抗氧化肽具备高活性的关键结构23。Cys的抗氧化机制包括 a 和 b 途径。罗非鱼骨肽 DCGY（Asp-Cys-Gly-Tyr）和 NYDEY（Asn-Tyr-Asp-Glu-Tyr）对羟基自由基清除活性（hydroxy radical scaven-ging activity，HRSA）的 IC50分别为 27.6、38.4 g/mL，肽 DCGY 序列中的 Cys 侧链的-SH 提供氢原子与自由基直接作用，使肽 DCGY具有更小的 IC50值24。R +O2=ROO O2O2O2ROO +R-H=L +ROOHR 自由基ROO 过氧化自由基ROOH过氧化物a.氢原子转移清除自由基ROO +Hpetides=ROOH+petides Ser ThrGly LeuVal Glub.单电子转移清除自由基ROO +Hpetides =ROOH+petides 含硫氨基酸芳香族氨基酸c.熬合金属离子Metaln+lipidOOHmetal(n+1)+OH+lipidO 酸性氨基酸碱性氨基酸d.长脂肪族侧链与脂溶性 自由基或脂肪酸相互作用疏水性氨基酸O2图 1 不同氨基酸在抗氧化肽中的作用机制Fig.1 Action mechanism of different amino acid residues in antioxidant peptides 420 食品工业科技2023 年 7 月 表 1 抗氧化肽的作用机制Table 1 Action mechanism of antioxidant peptides氨基酸结构特性肽序列抗氧化能力蛋白来源Cys（C）Cys侧链的-SH提供氢原子与自由基直接作用，Cys因具有共振结构而能维持抗氧化的稳定性DCGY和NYDEYHRSA罗非鱼24HRDRLCVVQORAC、ABTS鲈鱼22Met（M）Met结构的S原子可以提供电子从而被氧化成Met亚砜，Met因具有共振结构而能维持抗氧化的稳定性GGGAGMLLKORAC、ABTS鲈鱼22PMRGGGGYHYORAC合成肽41His（H）His的咪唑环提供氢原子，以电子共轭的方式稳定自身结构，从而阻断自由基链式反应ATSHHDRSA沙鱼53TAGHPGTHORAC鲮鱼54NHRYDR和GNRGFACRHADRSA、HRSA马鲭鱼和黄鱼3Asp（D）和Lys（L）Asp的羧基O原子、Lys的羧基O原子和它的氨基N原子KGDPGLSPGK金属离子螯合太平洋鳕鱼64Arg（R）Arg的侧链能提供氢原子与ABTS自由基发生反应GLFGPR和GATGPQGPLGPRABTS鲈鱼55Arg能通过其带电残基与金属离子相互作用，并使金属离子的氧化活性失活FLGSFL和YEYSRABTS和FICP鲷鱼56Arg位于靠近N末端第三个位置，GDRGEESGPA在所有肽中具有最强的抗氧化活性GDRGEESGPA、NHRYDR和GNRGFACRHADRSA鲟鱼57His（H）、Lys（L）和Arg（R）His、Lys和Arg提供的电荷吸引力、氢键、碳氢键、烷基键和烷基键有助于VIFFVTMGTPR与Keap1结合，阻断Nrf2信号通路VIFFVTMGTPRSOD、GSH含量提高，MDA含量降低黑线鳕鱼58Glu（E）Glu的侧链可以提供一个氢原子作为还原剂，猝灭未配对电子和自由基，其可带电性也能中和启动子金属离子的活性VPR、IEPH、LEEEE、IEEEQORAC赤魟60Glu去除H2O2过程中，序列中的Glu通过产生氧化型GSH来提供抗氧化活性VEDRSA扁舵鲣43Glu（E）和Asp（D）Glu通过其侧链的带电基团排斥带有负电荷的自由基WMFDW和EMGPADRSA、SRSA、HRSA和还原力鲣鱼62Glu（E）和His（H）Glu的羧基、His的羧基和氨基EPAH金属离子螯合扁舵鲣67Asn（N）和Asp（D）Asp和Asn使肽具有优秀的金属离子螯合能力PGMLGGSPPGLLGGSPPDRSA和FICP黑鱼78Glu（E）/Gln（Q）或Asp（D）/Asn（N）C末端旁边第二个氨基酸位置是Glu/Gln或Asp/Asn，能更有效地中断氧化链式反应LVPVAVF、ISTSLPV、MYPGIGDR和ADLVHVQDRSA鲢鱼63Glu（E）、Asp（D）、Lys（L）和Arg（R）Glu和Asp的羧基，以及Lys和Arg的氨基DGPSGPKGDRGETGLFICP罗非鱼70Phe（F）Phe通过电子的共振或离域来稳定各种形式的ROS，将其转化为更稳定的苯氧基FLNEFLHVDRSA、ABTS鲑鱼29Phe的芳香环可以与羟基自由基反应，生成m-Tyr和o-TyrWDR和PYFNKDRSA、ABTS、HRSA路氏双髻鲨9293Tyr（Y）Tyr的抗氧化活性可能与酚基作为氢供体的特殊能力有关PYSFK、GFGPEL和VGRPDRSA、ABTS、HRSA草鱼34EGL和YGDEYHRSA罗非鱼32Tyr增加了与脂类相互作用的可能，并通过质子捐赠清除脂类衍生的自由基WGDAGGYY自由基清除能力和抑制亚油酸自氧化活性金枪鱼94Trp（W）Trp将吲哚基团中的质子捐赠给缺电子的自由基，保持自由基稳定WAFAPAABTS古氏魟16Leu（L）和Val（V）Leu和Val的侧链烯丙基氢含有丰富且活性高的氢原子，易与自由基反应ACFL抑制多不饱和脂肪酸氧化马鲭鱼4Pro（P）Pro的吡咯环可以增加肽的柔韧性，并且由于其具有较低的电离势，可以猝灭单线态氧GAGGPDRSA扁舵鲣43Val（V）和Pro（C）疏水基团可以促进肽与疏水自由基物种的接触VSSKDRSA金枪鱼95Phe、Trp、Val、Lys、Met、Pro、Leu和HisFWKVV和FMPLHHRSA、DRSA、SRSA鮸49疏水性氨基酸DLVKVEADRSA黑鳗鱼96Thr（T）Thr的羟基基团可以提供氢原子PGGTMDRSA和ORAC黑鲨鱼97ILGATIDNSKDRSA和ABTS圆鲟47TVAABTS水牛与牛乳酪39Ser（S）Ser的羟基参与了肽的抗氧化过程WCTSVS防止DNA损伤和抑制脂质过氧化印度鱿鱼48Gly（G）Gly侧链上的单个氢原子可以充当质子供体，并中和活性自由基IYGDRSA、HRSA和SRSA和还原力带鱼42第 44 卷 第 14 期左依瑾，等：鱼源抗氧化肽的结构与其功能关系研究进展 421 从鲈鱼肌肉蛋白中鉴定得到的 HRDRLCVVQ（His-Arg-Asp-Arg-Leu-Cys-Val-Val-Gln）中 Cys 具有的-SH 能提供活跃的氢原子与自由基直接反应，Cys 因具有共振结构而能维持抗氧化的稳定性22。此外，三肽 CQV（Cys-Gln-Val）、QCV（Gln-Cys-Val）、QVC（Gln-Val-Cys）和 QCA（Gln-Cys-Ala）在清除羟基自由基的实验中，Cys 的抗氧化机制是通过-SH 键的断裂完成的，侧链的-SH 失去电子和氢原子后，消灭了自由基25。蓝圆鲹肌肉蛋白肽 HDHPVC（His-Asp-His-Pro-Val-Cys）和HEKVC（His-Glu-Lys-Val-Cys）的 DPPH 自由基清除能力（DPPH radical scavengingactivity，DRSA）和还原力超过天然抗氧化剂 VC和GSH，肽的抗氧化活性与序列中亲水氨基酸 Cys 和His 有关26。1.2芳香族氨基酸Phe、Tyr 和 Trp 能通过其芳香环、酚羟基或吲哚基团赋予肽抗氧化活性，它们的作用机制是图 1中的 b 途径，利用单电子转移去除自由基25，而 Tyr的作用机制还包括 a 途径。Phe 的结构中含有芳香环和酚羟基，它可以通过电子的共振或离域来稳定各种形式的 ROS，将其转化为更稳定的苯氧基，抑制自由基介导的过氧化链式反应的传播2728。鲑鱼胸鳍蛋白肽 FLNEFLHV（Phe-Leu-Asn-Glu-Phe-Leu-His-Val）具有较好的 DRSA、ABTS（ABTS radicals sca-venging activity，ABTS）自由基清除活性和还原力，肽序列中的 Phe 作为抗氧化活性位点使肽产生抗氧化效果29。Tyr 在结构上与 p-香豆酸相似，p-香豆酸是一种芳香环上存在一个羟基且具有强抗氧化活性的酚类化合物30。肽链中 Tyr 的抗氧化机制是其酚羟基能作为氢供体清除自由基，而且 Tyr 也对目标疏水蛋白有很强亲和力31。尼罗罗非鱼皮肽 YGDEY（Tyr-Gly-Asp-Glu-Tyr）具有较强 HRSA 活性，序列中的活性位点是因为 C 端和 N 端存在的 Tyr32。从鲤鱼皮肤蛋白中提取得到的肽 AY（Ala-Tyr）具有较好的亚铁离子螯合能力（ferrous ion chelating capa-city，FICP）、还原力和 DRSA，经过体外消化后具有强稳定性，C 端 Tyr 的存在增强了自由基的清除活性33。草鱼皮蛋白肽有 PYSFK（Pro-Tyr-Ser-Phe-Lys）、GFGPEL（Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Leu）和 VGRP（Val-Gly-Arg-Pro），其中 PYSFK 具有最强的 DRSA和 ABTS 自由基清除能力，这归功于肽序列的芳香族氨基酸 Tyr 的酚羟基发挥作用，而肽序列中不含芳香族氨基酸的 VGRP的抗氧化能力最弱34。Trp是一种侧链有吲哚基团的非极性芳香族氨基酸35，吲哚基比过氧自由基更稳定，寿命更长，因此任何逆反应或自由基介导的过氧连锁反应的传播都会受到抑制36。Trp 将吲哚基团中的质子捐赠给缺电子的自由基，从而保持自由基稳定，提高肽的自由基清除活性36。古氏魟蛋白肽 WAFAPA（Trp-Ala-Phe-Ala-Pro-Ala）比 GSH 有更强的抗氧化活性，其中 Trp 发挥了重要作用16。1.3部分疏水性氨基酸疏水性氨基酸包括 Leu、Val、Gly、Pro、Met、Phe、Trp、Ala 和 Ile，疏水性氨基酸有利于提升肽在水油介质中的溶解度16，增加对脂溶性自由基或多不饱和脂肪酸的可及性和相互作用3738，促进质子向脂质衍生的自由基的递送过程，抑制氧化损伤的产生36。如图 1 的作用机制 d 所示，含有 Leu 和 Ala的肽的抗氧化能力归因于它的长脂族侧链35，能够与易感脂肪酸的酰基链发生相互作用，马鲭鱼内脏肽ACFL（Ala-Cys-Phe-Leu）含有 Leu 和 Ala，其抑制多不饱和脂肪酸的能力高于天然抗氧化剂-生育酚4。此外，Leu 和 Val 的侧链烯丙基氢含有丰富且活性高的氢原子，容易与自由基反应39，因此，Leu 和 Val 符合图1 中a 和b 抗氧化机制。大黄鱼鱼鳞肽QRPPEPR（Gln-Arg-Pro-Pro-Glu-Pro-Arg）、EKVWKYCD（Glu-Lys-Val-Trp-Lys-Tyr-Cys-Asp）和 VGLPGLSGPVG（Val-Gly-Leu-Pro-Gly-Leu-Ser-Gly-Pro-Val-Gly），它们的 DRSA 清除率分别为 55.1%、55.1%和 59.1%，肽序列中含有两个 Val 的 VGLPGLSGPVG 对 DPPH自由基的清除效果最好40。Gly 和 Pro 通过其特殊结构赋予肽抗氧化活性，而且 Gly 和 Pro 能影响肽的二级构象4041，进而影响功能活性。Gly 的抗氧化机制是图 1 中的 a 途径，氨基酸作为供氢体，通过转移氢原子清除自由基。Gly 侧链由一个氢原子组成，为肽的主链提供高度灵活性，因而改变肽的空间结构。Wu 等41发现随着合 成 肽 序 列 PMRGGGGYHY（Pro-Met-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Tyr-His-Tyr）中 Gly 的减少，肽键形成的分子内氢键的数量越少，抗氧化肽更多的活性位点暴露出来，ORAC 逐渐增强。带鱼肌肉蛋白肽 IYG（Ile-Tyr-Gly）之所以具有较高的自由基清除能力、还原能力和亚油酸模型体系中的抑制脂质过氧化能力，是因为 Gly 侧链上的单个氢原子可以充当质子供体，中和活性自由基，而且其肽链短的优势更容易让肽的活性位点接触到靶点，有助于肽发挥生物活性42。Pro 可以诱导二级结构弯曲，增加氨基酸发挥作用的可用性40。Pro 的作用机制是图 1 中的 b 途径，利用单电子转移去除自由基。扁舵鲣蛋白肽GAGGP（Gly-Ala-Gly-Gly-Pro）具有较好的 DRSA活性43，序列中的 Pro 有一个富含电子的吡咯烷酮环，由于其较低的电离势，可以增加肽链的灵活性，也可以淬灭单线态氧4344，从路氏双髻鲨软骨蛋白中提取得到含有 Pro 的肽 GPE（Gly-Pro-Glu）在亚油酸模型体系中表现出类似于抗氧化剂 BHT 的脂质过氧化抑制活性，其芳香侧链在抗氧化反应中充当电子给体45。1.4部分中性氨基酸如图 1 的 a 途径所示，Asn、Gln、Thr 和 Ser 可以作为氢供体，通过提供氢原子阻碍抗氧化反应。在 422 食品工业科技2023 年 7 月中性 pH 环境下，Asn 和 Gln 可以提供氢原子，进而吸引带有正电荷的自由基来增加肽的抗氧化活性20。Thr 和 Ser 都可以作为氢供体来中和自由基。黑鲨鱼皮中鉴定得到的含有 Thr 的五肽 PGGTM（Pro-Gly-Gly-Thr-Met）被报道具有强 DRSA 和 ORAC46。在圆鲟蛋白中鉴定得到的所有肽中，肽序列中 Thr使 肽 ILGATIDNSK（Ile-Leu-Gly-Ala-Thr-Ile-Asp-Asn-Ser-Lys）具有最强的 DRSA 和 ABTS 自由基清除能力47。印度鱿鱼寡肽 WCTSVS（Trp-Cys-Thr-Ser-Val-Ser）Ser 的羟基参与了该肽的抗氧化活性，防止 DNA 损伤和抑制脂质过氧化48。而且，一同分离出的寡肽 SVNVPLY（Ser-Val-Asn-Val-Pro-Leu-Tyr）被报道其还原力显著高于 YRIVPL（Tyr-Arg-Ile-Val-Pro-Leu）的原因是前者的 N 端存在 Ser30。1.5碱性氨基酸His、Lys 和 Arg 是抗氧化肽序列中常见的碱性氨基酸。His 的作用机制包括图 1 中的 a、b 和 c 途径25。His 的咪唑基团和 Arg 的侧链能提供氢原子与自由基反应，使肽发挥抗氧化作用。His 的咪唑基团是抗氧化肽的重要活性位点28，因为它可以作为氢供体和脂质过氧自由基陷阱49。同时 His 可以通过给电子将自由基转化为稳定分子，同时通过共振结构保持自身的稳定性50。而且咪唑的氧化产物是咪唑啉酮，咪唑啉酮也具有抗氧化活性51。Chen 等52发现，采用 D-His 取代抗氧化肽 PHH（Pro-His-His）中的 L-His 会导致其活性下降，推测这与咪唑环的位置、方向和其供电子能力有关。沙鱼肌肉蛋白肽ATSHH（Ala-Thr-Ser-His-His）序列中含有两个 His，在 1 mg/mL 的浓度下，寡肽对 DPPH 自由基的清除能力高达 90%以上，这归因于 His 咪唑基团的供质子能力53。鲮鱼皮蛋白肽 TAGHPGTH（Thr-Ala-Gly-His-Pro-Gly-Thr-His）具有 ORAC 活性，序列中His 的咪唑环提供氢原子，以电子共轭的方式稳定自身结构，从而阻断自由基链式反应54。Lys 的抗氧化机制如图 1 中的 c 途径所示，带正电荷的碱性氨基酸与带相反电荷的金属离子结合，阻碍氧化链式反应的进行。Arg 的抗氧化机制包括图 1 中的 a 和 c 途径。Arg 的侧链能提供氢原子与 ABTS 自由基发生反应，海鲈鱼皮肽 GLFGPR（Gly-Leu-Phe-Gly-Pro-Arg）和GATGPQGPLGPR（Gly-Ala-Thr-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg）具有较强的抗氧化能力，两个肽的 C 末端包含的 Arg 赋予肽抗氧化能力55。鲷鱼鱼糜肽 FLGSFL（Phe-Leu-Gly-Ser-Phe-Leu）和YEYSR（Tyr-Glu-Tyr-Ser-Arg）具有较强的 ABTS 自由基清除能力和 FICP，这是因为序列中的 Arg 能通过其带电残基与金属离子相互作用，并使金属离子失去氧化活性56。鲟鱼皮蛋白肽 GDRGEESGPA（Gly-Asp-Arg-Gly-Glu-Glu-Ser-Gly-Pro-Ala）是鉴定中获得的所有肽中具有最强的 DRSA 活性的肽57，Arg在肽序列中的存在和位置决定了肽的抗氧化活性，当 Arg 位于靠近 N 末端的第三个位置时具有较好抗氧化活性3，而其他肽具有较低 DRSA 活性的原因是序列中缺乏 Arg。除了图 1 中的抗氧化机制外，His、Lys 和 Arg 也具有细胞内抗氧化能力，董丽莎等58采用分子对接发现黑线鳕鱼皮中鉴定的肽 VIFFVTMGTPR（Val-Ile-Phe-Phe-Val-Thr-Met-Gly-Thr-Pro-Arg）与 Keap1 蛋白结合最稳定，序列中的 His、Lys和 Arg 所提供的电荷吸引力、氢键、碳氢键、烷基键和 烷基键有助于二者紧密结合，阻断核转录因子（NF-E2-related factor 2,Nrf2）信号通路，实现对人表皮角质形成细胞（HaCaT）的抗氧化保护效应。1.6酸性氨基酸酸性氨基酸包括 Glu 和 Asp，其抗氧化机制如图 1 的 a 和 c 途径所示，Glu 和 Asp 既能清除自由基，还能螯合金属离子，减弱金属离子的促氧化作用，抵抗脂质氧化20。Glu 的侧链还可以提供一个氢原子作为还原剂，猝灭自由基59。赤魟软骨蛋白肽VPR（Val-Pro-Arg）、IEPH（Ile-Glu-Pro-His）、LEEEE（Leu-Glu-Glu-Glu-Glu）和 IEEEQ（Ile-Glu-Glu-Glu-Gln）具有强自由基清除能力，序列中的 Glu 是肽的主要活性位点60。甲鲶鱼水解液的 ORAC 值与蓝莓、苹果和橙子等水果的 ORAC 值相似，从中鉴定的多个肽序列都存在 IEE（Ile-Glu-Glu）或 IEEE（Ile-Glu-Glu-Glu）序列，IEE 重复序列是高抗氧化活性的部分原因61。扁舵鲣蛋白肽 VE（Val-Glu），在去除H2O2过程中，序列中的 Glu 通过产生氧化型谷胱甘肽（glutathione，GSH）来提供抗氧化活性43。鲣鱼鱼头蛋白肽 WMFDW（Trp-Met-Phe-Asp-Trp）和 EMGPA（Glu-Met-Gly-Pro-Ala），肽序列的 Asp 和 Glu 在清除羟基自由基的过程中起着关键作用62。鲢鱼肌肉蛋白肽 MYPGIGDR（Met-Tyr-Pro-Gly-Ile-Gly-Asp-Arg）和 ADLVHVQ（Ala-Asp-Leu-Val-His-Val-Gln）都具有较强 DRSA，C 末端旁边第二个氨基酸位置是 Glu 或 Asp 能更有效地对中断氧化链式反应，减少有害 ROS 的产生，有助于增强肽的自由基清除活性和还原能力63。2一级结构与金属离子螯合能力的关系鱼类抗氧化肽容易与 Ca2+、Fe2+和 Zn2+等金属离子通过配位共价结合或者吸附结合3,6466。金属离子与酸性氨基酸的羧基基团形成离子键，与碱性氨基酸的氨基基团形成配位键60。Zhang 等64从水解太平洋鳕鱼骨中得到与 Ca2+结合的 KGDPGLSPGK（Lys-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-Lys），通过分子对接技术发现螯合作用的特异性结合位点是Asp-3 的羧基 O 原子、Lys-10 的羧基 O 原子、Lys-10的氨基 N 原子。Chen 等67已从扁舵鲣蛋白肽 EPAH（Glu-Pro-Ala-His），其 Ca2+螯合位点是 Glu 的羧基、His 的羧基和氨基。如图 2 所示，WALTERS 等分别从小麦和太平洋鳕鱼中得到的五肽 FVDVT（Phe-Val-Asp-Val-Thr）和十二肽 AGPHGPPGKDGR（Ala-第 44 卷 第 14 期左依瑾，等：鱼源抗氧化肽的结构与其功能关系研究进展 423 Gly-Pro-His-Gly-Pro-Pro-Gly-Lys-Asp-Gly-Arg），其主链上的 N 端的氨基、C 端的羧酸、肽键的 C=O基团和 His 的亚胺基团参与了肽与金属离子的螯合68。当前所鉴定的亚铁离子螯合肽的结合位点主要与亲水性氨基酸（Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Lys、Ser、Thr 和 Tyr）有关69。Lin 等70从罗非鱼皮胰蛋白酶水解液中分离出的 4 个肽 GPAGPAGEK（Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Glu-Lys）、DGPSGPKGDR（Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Lys-Gly-Asp-Arg）、GLPGPSGEEGKR（Gly-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Gly-Glu-Glu-Gly-Lys-Arg）和DGPSGPKGDRGETGL（Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Lys-Gly-Asp-Arg-Gly-Glu-Thr-Gly-Leu）都具有 FICP，Fe2+主要与肽序列中 Glu和 Asp 的羧基，以及 Lys 和 Arg 的氨基结合。Sampath等3从马鲭鱼和黄鱼中分别鉴定得到肽 NHRYDR（Asn-His-Arg-Tyr-Asp-Arg）和 GNRGFACRHA（Gly-Asn-Arg-Gly-Phe-Ala-Cys-Arg-His-Ala）具 有同天然抗氧化剂 EDTA 活性相当的 FICP，而且NHRYDR 在亚油酸体系中的抗氧化能力超过天然抗氧化剂 a-生育酚，两个肽的抗氧化活性主要是其序列中 His 的贡献。Mendis 等71从巨型乌贼中鉴定的肽FDSGPAGVL（Phe-Asp-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Val-Leu）和NEPLQAGQPGQPGR（Asn-Gly-Pro-Leu-Gln-Ala-Gly-Gln-Pro-Gly-Glu-Arg）没有金属离子螯合能力，这似乎是肽序列中缺少 His 的缘故。郭洪辉等65利用紫外光谱发现河豚皮寡肽与 Zn2+的结合位点是 C=O 和 N-C-O。此外，位于 N 端的 Pro 弯曲肽的二级结构的特点能增强肽作为金属离子螯合剂的能力72，而且富含 Pro 的肽因为具有空间位阻，能抵抗消化，增强肽作为金属离子螯合剂的稳定性73。氨基酸侧链的基团与金属离子螯合活性有关，带正电的碱性氨基酸侧链上的羧基失去氧原子与金属离子形成络合物60，带负电的酸性氨基酸侧链上的氨基失去氮原子，氮原子未共享的电子对与金属离子结合，酸性氨基酸螯合 Fe2+的还原方式与抗坏血酸类似61，生成具有三齿结构的稳定铁螯合物73。碱性氨基酸的羧基、Asp 的游离-羧基和 Glu 的游离-羧基与金属离子结合73，His 的咪唑环、Cys 的巯基、Trp 的吲哚基和 Thr 的羟基1以及 Ser 的羟基74可以提供额外的金属离子结合位点。3二级结构与抗氧化活性的关系肽的二级结构包括-螺旋、-折叠、-转角、无规卷曲。来源于-乳球蛋白的多肽 WYSLAMAASDI（Trp-Tyr-Ser-Leu-Ala-Met-Ala-Ala-Ser-Asp-Ile）的ORAC 活性比抗氧化剂 BHA 强，而且相对应的等摩尔游离氨基酸的混合物具有更高活性，而寡肽YVEEL（Tyr-Val-Glu-Glu-Leu）却正好相反，其氨基酸混合物的 ORAC 比寡肽低 2 倍75。这说明肽键或者肽链的空间结构既可能降低也可能提高多肽的抗氧化活性。3.1-螺旋结构-螺旋主要通过羰基氧（-CO）和氨基氢（NH-）两种基团之间的分子内氢键形成，氨基酸越多的肽更容易形成-螺旋结构28。-螺旋结构区域具有较高的两亲性，有助于肽在界面发挥抗氧化作用76。-螺旋在肽的抗氧化能力中发挥着关键作用，鲑鱼皮水解液具有较好的自由基清除能力，采用红外光谱分析其二级结构，其中-螺旋含量占比最高，无规卷曲含量占比最低，水解液的 ABTS、HRSA 和超氧自由基清除活性（superoxide anion radical scavenging capacity，SRSA）分别为 1.86、1.65 和 2.72 mg/mL77。也有研究结果表现出-螺旋比例越低，肽具有的抗氧化能力更强。由拉普光谱测定金线鲷肌肉水解物的二级结构，-螺旋占比最大，为 47.88%，无规卷曲占比最 CH3CH3H3CH3CH3CNH2NH2CH3NH2CH3NHNHONOOOOONHNHNH2NH2NHHNHNNHNHHNNNHCH3CH3H3CNHOOHOOH3CONHNHNHNHOOHOHOOOONNOOOOOFeHNHNNHOOOOOOOHOOOCa图 2 五肽和十二肽与金属离子结合的结构图F