邻位连接技术：一种新的高灵敏度蛋白质检测技术.pdf

ISSN100727626CN1123870Q中国生物化学与分子生物学报Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology2008年4月24(4):383389 技术与方法邻位连接技术:一种新的高灵敏度蛋白质检测技术李丹滢1),周国华1),2)3(1)中国药科大学生命科学与技术学院,南京 210009;2)华东医学生物技术研究所,南京 210002)摘要 蛋白质组学(proteomics)诞生以来,高效准确的蛋白质检测技术受到越来越多的关注.最近,一种高灵敏度的蛋白质检测技术,邻位连接技术(proximity ligation assayPLA)被建立.该技术采用核酸适体(aptamer)或单 多克隆抗体2核酸复合物作为邻位连接探针(proximity probes).当一对邻位探针同时识别同一个目标蛋白分子时,它们将在空间位置上相互临近,通过连接反应形成一段可扩增的DNA标签序列,该标签序列能够反映待测蛋白的种类及浓度.该技术将对蛋白质的检测转变为对DNA核酸序列的检测,实现了特殊蛋白质的检测,定量及定位.文章从该方法的产生背景,发展过程,原理以及探针制备等方面对该方法进行了系统的介绍,列举了该方法的几种重要应用,并对该方法在蛋白质组学研究领域的应用前景进行了展望.关键词 邻位连接技术;蛋白质组学;蛋白质检测中图分类号 Q51Proximity Ligation Assay:A Newand Highly Sensitive Protein Detection MethodLI Dan2Ying1),ZHOU Guo2Hua1),2)3(1)College of Life Science and Technology,China Pharmaceutical University,Nanjing210009,China;2)Huadong Research Institute for Medicine and Biotechnics,Nanjing210002,China)AbstractEfficient and precise techniques for protein detection are crucial in proteomics studies.Recently,proximity ligation assay(PLA),a new protein detection technique in proteomics,was developed,andattracting more and more researchers in the field.The proximity probes,aptamers or complexes of monopolyclonal antibody with oligonucleotide,are designed to bind pairwise to target proteins and be able to giverise to an amplifiable DNA sequence tag by ligation when brought in proximity,which reflect the identities andamountsof the target proteins.This approach employs the analysis of DNA sequences instead of the directdetection of specific proteins,thus achieve high-sensitivity for the detection,quantification,and evenlocalization of targeted proteins.The basic principle and the potential applications of PLA,as well as sometechnical issues,such as the preparation of the proximity probes,will be discussed in this review.Key wordsproximity ligation assay;proteomics;protein detection收稿日期:2007209227;接受日期:2007211230国家自然科学基金资助(No.30470454)3联系人 TelFax:025284514223,E2mail:ghzhou Received:September 27,2007;Accepted:November 30,2007Supported by National Natural Science Foundation of China(No.30470454)3Corresponding author TelFax:025284514223,E2mail:ghzhou 人类基因组计划因毛细管阵列电泳测序技术的发展得以提前完成1.像毛细管阵列电泳一样,二维电泳技术特别是色谱2质谱联用技术的发展,也大大加快了蛋白质组学(proteomics)的研究步伐2.但是,蛋白质分子比DNA分子复杂的多,要在分子水平上阐述表达量极低的蛋白质在生理过程中所扮演的角色,就必须建立一种相应的高灵敏度、高专一性的检测方法.早在1985年,聚合酶链反应(PCR)技术就已被用于微量DNA扩增及检测,理论上可以检测到单个DNA分子,而且特异性也很好3.可是蛋白质分子和DNA分子不同,它不能通过扩增技术使目的蛋白的分子数目增加,只能采用直接测定法,因此,检测灵敏度受到极大限制.如果能用一种类似于PCR的扩增技术扩增蛋白质分子,那蛋白质的检测灵敏度就会大大提高,这对分析单细胞中蛋白质的变化、对细胞及组织中的蛋白质进行定位、观察不同蛋白质之间的相互作用等有重要意义,同时可以实现疾病的早期诊断,对重大疾病如肿瘤起到预警作用.最近,ULF Landegren研究小组提出了一种新的蛋白质体外分析方法,称为邻位连接技术(proximityligation assay,PLA)4.该方法通过一对亲和探针对目的分子双识别,继而产生可扩增的检测信号,从而将对蛋白质的检测转变成为对DNA的检测,实现了痕量蛋白的分析,其检测灵敏度是酶联免疫吸附法(ELISA)的1 000倍.本文将对邻位连接技术的原理,探针的制备以及该技术的应用做综述.1PLA法的背景及原理从上世纪70年代连接酶被首次发现至今,以酶连机制为基础的实验技术,如寡核苷酸链接检测法(oligonucleotide ligation assay,OLA)5,连接酶链反应(ligase chain reaction,LCR)6等已经成为当今分子生物学领域一项基本的技术.Landegren等早在1994年就对LCR技术进行了改进,设计了一种称为挂锁探针(padlock probe)的环状探针7.“挂锁”为一条线状的寡聚核苷酸单链,其两端可与靶序列互补.当“挂锁”两端与靶序列杂交继而并列靠近时,探针的两个末端可以在DNA连接酶的作用下连接成环.这种环状探针可用于分辨只有1个碱基存在差异的基因序列.PLA技术便是在此基础之上建立起来的一种新的蛋白质体外分析方法.该技术首先将不同的DNA单链分别与蛋白质识别分子相结合,形成所谓的PLA探针.经过类似酶联免疫吸附法(ELISA)中的温育过程,2条含有不同DNA序列的PLA探针会同时结合到同1个待测蛋白质分子上.此时,2条探针的DNA尾部便在空间上紧密靠近.在过量的互补连接序列和DNA连接酶的作用下,2条探针DNA尾部的游离5 端和3 端与互补序列杂交并发生连接反应,形成1个环状的蛋白质-蛋白识别分子-单链DNA复合物.该复合物量的多少,完全取决于样品中待测蛋白质分子的量.采用定量实时荧光PCR对复合物中的单链DNA部分扩增,对连接复合物进行定量,使对蛋白质的检测转变为对DNA的检测,实现了痕量蛋白质的分析8(Fig11,见387页彩版).该方法已成功检测到1l样品中fmol级的蛋白质分子,其检测灵敏度是ELISA的1 000倍.但背景信号较大却限制了该方法的检测灵敏度.背景信号是指在待测目的蛋白缺失的情况下,依然可检测到的信号.产生背景信号的原因10主要有:探针之间的非特异性结合;没有结合到蛋白质分子上的游离探针由于随机碰撞与连接互补序列杂交.这都可能引起连接反应的进一步发生,造成背景信号.Schallmeiner等11采用3条邻位探针,即只有当3条探针同时识别同一蛋白质分子时,连接反应才能发生(Fig12,见387页彩版).改良后的PLA技术被称为triple2binder proximity ligation assays,简称3PLA.同时,Schallmeiner等还设计了一种可与探针上DNA单链游离端互补的短序列,称为封闭寡聚核苷酸(blocking oligonucleotide).该序列具有一定的二级结构,当其与游离探针互补后,该二级结构可阻止游离探针与互补序列的退火连接.这一改进使得原有PLA技术的背景信号大大降低,同时检测灵敏度提高了100倍.为了进一步提高该方法的检测线性范围,Fredriksson等10对连接互补序列的碱基数、连接酶种类、连接温度、连接时间、连接体积、扩增方法等进行了系统的考察.在降低背景信号的同时,提高了检测线性范围.改进后的PLA已实现了多重PLA反应(目前已同时检测到实际样品中6种癌症标示物),可检测到1l样品中amol级的蛋白质分子,且均具有良好的线性范围.2PLA探针起初,PLA技术所用的探针是一种被称为核酸适体(aptamer)的DNA单链4.该核酸适体是通过一种体外筛选方法筛选而获得的,这一方法即指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands byexponential enrichment,SELEX)12.由SELEX筛选得到的核酸适体可与靶分子高特异性、高亲和力地结合,从而起到识别目的分子的作用.而且,核酸适体合成简单,储存容易,可更快地穿透组织,目前已被广泛应用于基础研究、诊断、治疗试剂的研制及药物筛选等领域13.但目前能够用于PLA技术的核酸适体种类有限14,这大大限制了核酸适体在该技术中的应用.抗体,不论是单抗、多抗还是重组片段,已经成为使用最广泛的蛋白质特异性识别分子,抗体与DNA结合物的作用也已在免疫PCR技术中得到肯定15.因此,Gullberg等14分别采用化学共价结合法和生物法,将DNA单链与抗体结合,制备出抗体2单483中国生物化学与分子生物学报24卷链DNA复合物,作为探针用于PLA反应.化学法是利用双功能交联试剂42p2maleimidophenyl butyrate(SMPB)将抗体与巯基修饰的DNA单链相结合;生物法则是利用链亲和素(streptavidin)与生物素(biotin)之间的高亲和力,先将马来酰亚胺修饰的链亲和素与巯基修饰的DNA单链结合,形成链亲和素2单链DNA复合物,经纯化除去游离的链亲和素以及游离的单链DNA后,链亲和素2单链DNA复合物可直接与生物素修饰的抗体按11的比例在室温下结合,无需进一步的纯化,便可形成终产物抗体2单链DNA复合探针.由于DNA与蛋白质结合的效率较低,故纯化很重要.Gullberg等14在利用生物法制备PLA探针时,设计了一套简单实用的纯化方法,整个纯化过程无需复杂的洗涤或色谱步骤.他们利用饱和硫酸铵对蛋白质的沉淀作用,除去游离的DNA单链;再利用乙醇沉淀法除去游离的链亲和素.由该方法得到的纯化后的链亲和素2DNA复合物,经芯片电泳定量分析,平均每个链亲和素分子上可以结合1个DNA分子,残留的游离DNA的量不到10%.更重要的是,对于不同的待测分子,只需改变抗体的种类即可.因此,一旦链亲和素2DNA复合探针制备成功,便可用于各种蛋白质分子的检测,这就大大降低了探针制备的成本.目前,PLA探针的制备正逐步走向商业化.已见报道10有国外公司(Solulink Inc.)可订做抗体2DNA复合探针,并通过分子排阻高效液相技术对探针进行纯化,得到的探针可直接用于PLA反应.这也大大减少了欲进行PLA反应的实验操作员用在探针制备上的时间.3PLA技术的应用311 用于细胞因子的检测PLA技术建立之初是用于细胞因子的检测.不论是DNA核酸适体探针,还是以抗体为蛋白识别分子的复合探针均在细胞因子的检测方面取得了成功.采用可特异性识别血小板衍生生长因子B链二聚体(platelet2derived growth factor B chain,PDGF2BB)的DNA核酸适体为PLA探针,当探针浓度仅为20 pmolL时,亦可检测到1l溶液中24 000个PDGF2BB分子.与ELISA相比,灵敏度提高了近1 000倍14.随后,对人凝血酶的检测进一步说明,PLA技术不仅可以采用同种DNA核酸适体探针,即Fig.3Limit of detection(LOD)for PLA in comparisonto other technologiesUsing binders from the same source,LODs for each technology type areencircled to illustrate their performance.The compared technologies are amultiplexed sandwich immunoassay with rolling2circle amplification ofsignals in an array format(ELISA2RCA),RnD Systems commercialindividual ELISAs,and RnD Systems antibodies used in Westernblotting.Thex axis shows the limit ofdetection measured asconcentrations of target protein;the y axis denotes amounts of targetdetectable,important when sample amounts are scarce.Proximityligation uses 12 l samples;ELISA uses 1002 l samples;RCA array andWestern blot use 102 l samples8便是针对待测分子上不同识别位点的2条不同探针,PLA技术依然有效.此外,如果待测的细胞因子含量过低,或者样品中含有连接和扩增的抑制剂时,采用固相PLA也是一个不错的选择.在连接前,先将待测细胞因子固定,不但可以对待测细胞因子进行纯化和浓缩,也可通过洗涤除去游离的PLA探针.结果表明,先将PDGF2BB固定在抗体包被的反应器中,再进行PLA反应,可以将检测范围降低至fmol水平.而改用抗体作为蛋白识别分子的探针后,只需要1g的抗体,便可发生大于100 000次的有效连接反应,无需固定和洗涤,也可检测到1l样品溶液中fmol水平的样品.PLA技术在检测细胞因子方面最突出的优点就是检测灵敏度高.从Fig.3可以看出,采用来源相同的同种蛋白识别分子,以PDGF2BB、IL22、IL24、血管内皮生长因子VEGF四种细胞因子为检测对象,对PLA技术、ELISA法、ELISA与滚环复制RCA相结合技术以及Western印迹的蛋白检测限进行了比较.从样品用量来看,PLA技术的样品消耗量为1l,RCA与Western印迹为10l,而ELISA则为100l.检测限方面,PLA的优势也是十分明显的.实际检测中,583第4期李丹滢等:邻位连接技术:一种新的高灵敏度蛋白质检测技术PLA的检测限可以达到ELISA的1 000倍,Western印迹的10 000 000倍.312 与滚环复制法(RCA)结合滚环扩增(rolling circle amplification),简称RCA,是一种以环状DNA分子为模板,在只有一条引物存在的情况下,由DNA聚合酶所介导的一种恒温PCR反应16.目前,RCA技术已经应用于定点突变的检测17以及多元蛋白的微阵列分析18.King等19率先将RCA与PLA相结合,设计了一系列可成环的邻位连接探针,只不过这些探针采用的是纯单链DNA形式的DNA核酸适体.利用这些环状DNA核酸适体,该方法可用于检测低至30pmolL的凝血酶蛋白溶液.Sderberg等20则创新性地利用了RCA反应的发生具有局部性这一特点,即反应在哪里发生,扩增产物就在哪里不断富集,建立了一种全新的,可对相互作用的蛋白质进行细胞定位的方法,即proximityligation in situ assay,简称P2LISA.在P2LISA方法中,邻位连接探针并非同时结合到同一个蛋白质分子上,而是与待测的2个具有相互作用的蛋白质分子分别结合.当这2个蛋白质分子因为相互作用而靠近时,邻位连接探针也因此相互靠近.此时,向反应体系中加入DNA短序列即连接互补序列,与探针上的DNA链互补,在连接酶的作用下形成可作为模板的环状DNA分子.而其中1个探针上的DNA链将充当扩增引物的角色.经过1h的PCR反应,可以形成1条含有约1 000个重复环状DNA序列的DNA单链.将其与荧光标记的DNA短序列结合,便可以直接观测到相互作用的两个蛋白质分子在细胞中的定位.整个流程见Fig.41Fig.5Schematic ofproximity probe2templated DNAcircularization using three proximity probesThree proximity probes directed at each of the three proteins bind inproximity and give rise to an amplifiable detection reaction由于环状DNA模板的成环反应不受邻位连接探针个数的影响,故P2LISA法可进一步应用于3个,甚至更多具有相互作用的蛋白质在细胞内的定位(Fig.5).从理论上来讲,通过改变邻位探针蛋白识别分子的种类以及单链DNA的长度,邻位探针还可以扮演分子尺的角色,用于测量2个抗原决定簇之间的距离.其最大可测距离估计在30 nm左右.目前,该方法已经对源癌基因表达产物c2Myc及其伙伴蛋白Max之间的相互作用,以及c2MycMaxRNA聚合酶 复合物三者之间相互作用进行了成功的细胞内定位;相信其在临床诊断方面将发挥更大的优势.313 用于DNA与蛋白质相互作用的体外检测序列特异性DNA片段与蛋白质结合,常常是诱导复制、重组、转录等生命过程的一个重要因素21.人类有6%的基因参与编码DNA结合的转录因子22;且DNA结合蛋白的突变常常是诱导人类疾病,特别是癌症的原因.遗憾的是,人们对这些DNA结合蛋白所对应的特异性序列的认识却很有限.用于研究DNA与蛋白质互作的传统方法有DNA2蛋白质印迹法(South2Western blotting)23,凝胶电泳迁移率变动分析EMSA)24;生化方法有DNase 印迹法(DNase I foot printing)25,甲基化干扰法(methylation interference assay);生物物理方法有荧光各向异性度(fluorescence anisotropy)26,荧光相关光谱(fluorescence correlation spectroscopy,FCS)27,单分子力谱(single2molecule force spectroscopy)28;以及目前广 受 好 评 的 染 色 质 免 疫 沉 淀 法(chromatinimmunoprecipitation,ChIP)29等.这些方法虽然均为目前研究转录调控蛋白和其相应核苷酸序列结合的常用方法,但都或多或少存在诸如耗时,试剂投入大,涉及甲基化或放射性物质,难以适应高通量分析等缺点.为此,Gustafsdottir等30在PLA的基础上,建立了一种分析体外DNA与蛋白质相互作用的新方法.针对某一DNA结合蛋白,该小组设计了1对不同的PLA亲和探针(Fig.6),1条是以多抗或单抗为识别分子的PLA探针,另1条则是1端为双链DNA的DNA核酸适体.探针的抗体或双链DNA端可以和待测DNA结合蛋白特异性结合;另1端则可以和连接互补序列杂交.一旦这对特异性探针同时结合到DNA结合蛋白上,探针的游离端便在连接互补序列和连接酶的作用下连接成1段可扩增的,能够代表DNA结合蛋白与双链DNA之间产生了相互作用的序列特异性模板.通过实时荧光PCR便可以直观地考察待测DNA结合蛋白与双链DNA之间是否存在互作.683中国生物化学与分子生物学报24卷Fig.1Schematic of proximity ligation assaysSetsof proximity probes that have bound their target protein are brought inproximity to each other.A connector oligonucleotide hybridizes to DNAextensions from adjacent probes,guiding enzymatic DNA ligation(redcircle).The ligated DNA sequence is then amplified using real2time PCRand detected9 该方法不涉及放射性物质,试剂与样品的消耗量小,灵 敏 度 高,无 需 特 殊 设 备,操 作 简 单.Gustafsdottir等已经利用这一新技术考察了与人类疾病相关的转录因子p53、HNF24、USF1.结果证明,用该方法所得到的结论不但与之前由其它方法所得的结果一致,而且灵敏度更高.相信该方法将在诊断癌症转录因子中发挥更大的作用.314 用于芽孢的检测随着PLA方法的不断成熟,其应用领域也在不断扩大.目前,PLA法的检测对象已经由细胞因子、蛋白分子等发展到了单细胞水平,并成功用于蜡状芽孢杆菌单个芽孢的检测31.为了使PLA探针能够吸附在单细胞表面,对细胞进行专一地、高灵敏度地检测,Levy等31对PLA探针做了改进.他们首先找到能够与枯草芽孢杆菌、Fig.2Schematic of the triple2binder proximity ligation assays(3PLA)(A)Blocking of free proximity probes by competition oligonucleotides(orange);(B)The target protein is recognized by a set of three proximity probes.Theproximity probes recognize distinct epitopes on target proteins,and the blocking oligonucleotides are outcompeted by the third proximity probe containing thetemplate sequence(orange);(C)The gap between the hybridizedoligonucleotides is spanned using a cassette oligonucleotide,which is added to the incubationreaction together with the ligase and the reagents for the amplification reaction.A specific,amplifiable DNA strand is formed via two DNA ligation reactions(red circles in C),and is detected by real2time PCR.Proximity probes that have failed to find their target are ligated to the blocking oligonucleotides andprevented from ligating to other proximity probesFig.4Schematic of P2LISAFirstly,two proximity probes bind close to each other,then subsequentlyadded linear connector oligonucleotides are guided to form a circularstructure covalently joined by enzymatic DNA ligation.After ligation,RCA is initiated usingone of the proximity probes as a primer.The RCAproductisdetectedthroughhybridizationoffluorescence2labeledoligonucleotides(blue)complementary to a tag sequence in the RCAproduct(green)Fig6Two kinds of PLA probes used in the analysis ofDNA2protein interactionsA DNA2binding protein can be investigated by using two affinity probes,each carrying an oligonucleotide extension.One of the probes would bean antibody directed against a particular DNA2binding protein,whereasthe other would consist of a partially double2stranded DNA sequencepotentially recognized by the same DNA2binding protein783第4期李丹滢等:邻位连接技术:一种新的高灵敏度蛋白质检测技术蜡状芽孢杆菌及炭疽芽孢杆菌的芽孢细胞表面特异性结合的多肽.随后将这些多肽通过一种荧光蛋白-藻红蛋白(phycoerythrin,PE)-分别与不同的DNA链相连,形成一种多价复合物,Levy等将其称为Burr(Fig.7).当两个Burrs同时结合到一个芽孢分子表面时,在连接互补序列和连接酶的作用下,Burr上的DNA链将形成一段可扩增的目的片段,用于实时荧光PCR的检测和定量.通过对PLA探针的用量以及连接互补序列浓度的调整,目前,这种Burr已经成功地检测到100个炭疽芽孢杆菌的芽孢,10个枯草芽孢杆菌的芽孢,1个蜡状芽孢杆菌的芽孢.Fig.7Construction of burrOligonucleotides and peptides are separately conjugated to PE.There are2 distinct oligonucleotide conjugates,one linked through its 5end andone linked through its 3end31对细菌芽孢的成功检测,也为PLA法在单细胞的定性定量、细胞表面蛋白相互作用及定位等方面的研究提供了重要的参考依据.4 展望毋庸置疑,蛋白质是生理功能的执行者,是生命现象的直接体现者,对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制.传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代的要求.要对生命的复杂活动有全面和深入的认识,必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究.国际上蛋白质组学研究进展十分迅速,不论是基础理论还是技术方法,都在不断进步和完善.相当多的蛋白质组数据库已经建立,相应的国际互联网站也层出不穷.然而,蛋白质的这些可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多.PLA技术的提出,将对复杂蛋白质的检测转变为对DNA的检测,并凭借着其检测灵敏度高,检测特异性强,样品损耗低,操作简单,检测设备常见等优势,在蛋白质含量检测,研究蛋白质间相互作用、DNA与蛋白质间相互作用等很多蛋白质组学相关领域已经取得了很好的研究成果.相信随着该技术被越来越多的科研工作者不断熟知,其在蛋白质组学研究领域的应用范围也将不断扩大,最终成为蛋白质组学的一项基本研究方法.参考文献(References)1 Zubritsky E.How analytical chemists saved the human genomeproject.or at least gave it a helping handJ.Anal Chem,2002,74(1):23A226A 2 Lambert J P,Ethier M,Smith J C,et al.Proteomics:from gelbased to gel freeJ.Anal Chem,2005,77(12):377123787 3 Saiki R K,Scharf S,Faloona F,et al.Enzymatic amplification ofbeta2globin genomicsequences and restriction site analysis fordiagnosisof sickle cell anemia J.Science,1985,230(4732):135021354 4 Fredriksson S,Gullberg M,JarviusJ,et al.Protein detection usingproximity2dependent DNA ligation 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