食品中五种致病性弧菌MPCR-DHPLC检测方法的建立.pdf

2008,Vol.29,No.10食品科学分析检测500食品中五种致病性弧菌MPCR-DHPLC检测方法的建立邵碧英1，王传得2，郑 晶1，黄晓蓉1,*，曹际娟3，陈 彬1，吴 谦1(1.福建出入境检验检疫局，福建 福州 350001；2.福建农林大学动物科学院，福建 福州 350002；3.辽宁出入境检验检疫局，辽宁 大连 116001)摘 要：采用试剂盒法提取 5 种致病性弧菌(霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和拟态弧菌)的基因组 DNA。分别合成 5 对特异性引物，对 PCR 反应体系进行优化后，建立了 5 种致病性弧菌间的 MPCR-DHPLC 检测方法。二重PCR-DHPLC 检测灵敏度可达到100CFU/ml。建立的MPCR-DHPLC 方法在食品中弧菌的检测上具有很好的应用价值。关键词：弧菌；基因组 DNA；多重 PCR；变性高效液相色谱Development of MPCR-DHPLC Detection Method for Five Pathogenic Vibrios in FoodsSHAO Bi-ying1，WANG Chuan-de2，ZHENG Jing1，HUANG Xiao-rong1,*，Cao Ji-juan3，CHEN Bin1，WU Qian1(1.Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Fuzhou 350001,China；2.College of Animal Science，Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China；3.Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Dalian 116001,China)Abstract：The genome DNAs of five pathogenic Vibrios were extracted by kit method,including Vibrio cholerae,V.parahaemolyticus,V.vulnificus,V.alginolyticus and V.mimicus,and their five pairs of special primers were composed,respectively.The MPCR-DHPLC detection methods among the five vibrios were developed after the PCR reaction systemswere optimized.The detection sensitivity of duplex PCR-DHPLC is 100 CFU/ml.The developed MPCR-DHPLC method hasgood application merit on detecting the Vibrios in foods.Key words：Vibrio；genome DNA；multiplex PCR(MPCR)；denaturalization high performance liquid chromatography(DHPLC)中图分类号：Q93-332 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)10-0500-05收稿日期：2008-06-27基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAK02A13-11)作者简介：邵碧英(1973-)，女，高级工程师，博士，研究方向为食品微生物检验。E-mail：*通讯作者：黄晓蓉(1958-)，女，主任技师，研究方向为食品微生物检验。E-mail：霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)、创伤弧菌(V.vulnificus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)和拟态弧菌(V.mimicus)是食品中常见致病性弧菌，也是进出口食品中要求检测的常见的微生物项目。聚合酶链反应(PCR)具有传统微生物检验方法无与伦比的优点，如快速、灵敏，已广泛应用于致病菌的检测。近年来，在 P C R 基础上发展的多重 P C R(multiplex PCR，MPCR)技术，在一个反应体系中可同时检测多个目的片段，可节约成本、提高检测效率，在致病性弧菌检测上的应用已有一些报道1-5，但都是采用凝胶电泳的方法来检测 MPCR 产物，步骤多，且要接触潜在的致癌物质溴化乙锭。变性高效液相色谱技术(DHPLC)是一种新近发展的先进技术，可用于PCR、MPCR 产物的快速分析。本实验选取 5 种主要的致病性弧菌(副溶血性弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌和拟态弧菌)为研究对象，拟建立这 5 种弧菌间MPCR-DHPLC 检测方法，并用于日常送检样品的检测。1材料与方法1.1菌株霍乱弧菌 本实验室保存；副溶血性弧菌标准菌株ATCC178 上海汉尼公司；拟态弧菌(1.1969)、溶藻弧菌501分析检测食品科学2008,Vol.29,No.10表1 5种弧菌的引物Table 1 Primers for 5 Virbios弧菌扩增基因引物名称序列(53)产物大小(bp)副溶血弧菌(V.p)不耐热溶血毒素基因TLH-FAAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG450TLH-RGCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC溶藻弧菌(V.a)胶原酶基因VAC-FCTTATGGGACTTCGGTGATGGCT210VAC-RCGCCCACCGCTTACTTTACTTTG创伤弧菌(V.v)溶细胞素基因VVHA-FTTGGTCCATTCGCCAGCAGTTAC582VVHA-RTGTTGGTTGACGAGCCCGCAGAG霍乱弧菌(V.c)胶原酶基因VCC-FCCTAATGAGCAACCGACTATCAAAGA155VCC-RTGTTCTGAAGCGGTGAGCCATAC拟态弧菌(V.m)溶血素基因VMH-FAAGGGAAAGTGAATCAGCAGCGAGTA243VMH-RCGACCATTTGTTGACGCCCATCT(1.1833)标准菌株 中科院微生物所菌种中心；创伤弧菌标准菌株(CMCPC 6)北京兰伯瑞生物技术有限公司。1.2试剂2 Taq PCR MasterMix、dNTP、DNA marker 厦门泰京公司；细菌基因组 DNA 提取试剂盒 天根生化科技有限公司；5 Buffer(含 15mmol/L MgCl2)、GoTaq DNA 聚合酶(5U/l)Promega 公司。1.3引物参照文献6，委托上海生工公司合成以下引物(表1)。引物用TE溶液(pH8.0)稀释至浓度为10mol/L，20保存备用。1.4基因组 DNA 的提取各取 100l 弧菌菌悬液，接种于 4ml 3%NaCl 营养肉汤中，37 1培养过夜。取 1ml 菌液，按照细菌基因组 DNA 提取试剂盒说明书提取 DNA，经 100 倍稀释后，于核酸蛋白分析仪上测定浓度，用 TE 溶液pH8.0)稀释至 50ng/l，20保存备用。1.55 种弧菌间多重 PCR 反应体系的确立检测 5 种弧菌中的 2 种共有 10 个组合，3 种的共有10 个组合，4 种的有 5 个组合。各组合的 PCR 反应体系中，2 TaqPCR MasterMix 15l，相应的 DNA 各1 l，各引物用量如下：二重 PCR，除 V.m 与 4 种弧菌的组合对应的体积比为 1：2 外，其他组合均为 1:1；三重 PCR，V.c+V.p+V.v 为 1:1:1，V.c+V.p+V.a、V.c+V.v+V.a、V.v+V.p+V.a 均为 1:1:2，V.m+V.p+V.c、V.m+V.p+V.v、V.m+V.c+V.v 均为 1:2:2，V.m+V.p+V.a、V.m+V.v+V.a、V.m+V.c+V.a 均为 1:2:4；四重 PCR，V.p+V.v+V.c+V.a 为 1:1:1:2，V.m+V.p+V.v+V.c 为1:2:2:2，V.m+V.p+V.v+V.a、V.m+V.p+V.c+V.a、V.m+V.v+V.c+V.a 均为 1:2:2:4(1 代表 0.4l)；ddH2O 补足至30l。五重PCR 反应体系包括：2 Taq PCR MasterMix15l，Go Taq DNA 聚合酶 0.2l，dNTP 0.4l，V.m的引物为 0.4l，V.p、V.c、V.v 的引物均为 0.8l，V.a的引物为 1.6l，DNA 各 1l，ddH2O 0.6l。PCR 反应条件为：94预变性 3min；94变性 1min，60退火1min，72延伸 1min，40 个循环；72延伸 7min。反应结束后，取 10l PCR 产物，经 22mg/ml 琼脂糖凝胶电泳(98V，50min)检测。1.6MPCR-DHPLC 方法的建立PCR 反应体系中，5 Buffer 6l，各组合的引物用量同 1.5，DNA 各 1l，Go Taq DNA 聚合酶和 dNTP的用量如下：二重 PCR，酶 0.4l，dNTP 0.6l；三重PCR，酶0.5l，dNTP 1.2l；四重PCR酶0.7l，dNTP1.2l；五重 PCR，酶 1.0l，dNTP 1.8l；ddH2O 补足到 30l。反应结束后，PCR 产物进行 DHPLC 检测，上样量 5l，洗脱液由缓冲液 A(0.1mmol/L 的 TEAA)和缓冲液 B(0.1mmol/L 的 TEAA，含 25%的乙腈)组成，以0.9ml/min 的流速在 50下自动洗脱 DNA 分子，跑样时间为 20min，用峰对应的碱基对大小来判断 PCR 产物是否 正 确。1.7MPCR-DHPLC 检测灵敏度的测定将霍乱弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌的菌悬液分别进行 10 倍系列稀释，各取 1ml 菌液进行平板计数。另取 1ml 菌液用试剂盒法提取 DNA，最后用 20 l 洗脱液洗脱 DNA，各取 2l 作为反应模板，分别进行霍乱弧菌和副溶血性弧菌、溶藻弧菌和副溶血性弧菌的二重 PCR。反应结束后，取 5l 进行 DHPLC 检测。1.8MPCR-DHPLC 方法的应用将建立的MPCR-DHPLC检测方法用于本实验室2008年 45 月的送检进出口食品中副溶血性弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌的检测。取样 25g，加到 225ml碱性蛋白胨水中，均质，37 1培养 24h。摇匀，吸取 1ml 增菌液，12000r/min 离心 1min，弃上清。若沉淀太少，再取 1ml 增菌液，离心。沉淀用试剂盒法提取 DNA。根据样品检测项目，应用相应的 MPCR-DHPLC 检测其中的弧菌，检测结果同传统检验方法得到的结果进行比较。2结果与分析 2008,Vol.29,No.10食品科学分析检测502600A12345678910 11400200100600400200100BA.二重PCR 产物；1.V.p+V.m；2.V.p+V.c；3.V.p+V.v；4.V.p+V.a；5.V.m+V.c；6.V.m+V.v；7.V.m+V.a；8.V.c+V.v；9.V.c+V.a；10.V.v+V.a；11.DNA marker I。B.三重PCR产物；1.V.p+V.m+V.c；2.V.p+V.m+V.v；3.V.p+V.m+V.a；4.V.p+V.c+V.v；5.V.p+V.c+V.a；6.V.p+V.v+V.a；7.V.m+V.c+V.v；8.V.m+V.v+V.a；9.V.c+V.v+V.a；10.V.a+V.c+V.m；11.DNA marker I。图 1 二重、三重 PCR 产物Fig.1 Products of duplex and triplex PCR12345676004002001.V.p+V.m+V.v+V.a；2.V.p+V.m+V.v+V.c；3.V.p+V.m+V.a+V.c；4.V.p+V.v+V.a+V.c；5.V.m+V.v+V.a+V.c；6.DNA marker；7.V.v+V.p+V.m+V.a+V.c。图 2 四重、五重 PCR 产物Fig.2 Products of quadruple and quintuple PCR1234566004002001001.V.p；2.V.p+V.c；3.V.p+V.v+V.c；4.V.p+V.v+V.c+V.a；5.V.p+V.v+V.c+V.a+V.m；6.DNA marker I。图3 五重PCR反应体系的验证结果Fig.3 Validation result of quintuple PCR reaction system1.V.c+V.p；2.V.c+V.p+V.v；3.V.c+V.a+V.p+V.v；4V.c+V.a+V.m+V.p+V.v。图4 部分MPCR-DHPLC检测结果Fig.4 Partial MPCR-DHPLC detection results20100158mV时间(min)1112131415161747363020100158mV时间(min)1112131415161721147763220100156mV时间(min)11121314151647143210159mV时间(min)1213141516172122454716245234293953433182722281781801941892.15 种弧菌间多重 PCR 反应体系的确立结果由于 2 Taq PCR MasterMix 中包含了 DNA 聚合酶、缓冲液、dNTP、电泳上样缓冲液等成分，减少了 PCR 加样时的繁琐操作，PCR 产物可直接电泳，所以在优化引物用量时，选用了 2 Taq PCR MasterMix。另外，由于 DHPLC 检测结果图占用较大的空间，多重PCR 又有很多个组合，因此选用凝胶电泳法来检测 PCR产 物。经试验验证，2 Taq PCR MasterMix 最多可扩增四重 PCR，五重 PCR 需添加 DNA 聚合酶和 dNTP。5种弧菌间多重 PCR 产物的凝胶电泳结果如图 1、2 所示，各产物中相应的条带清晰，无杂带产生，表明引物比例合适，这为后面的 DHPLC 检测做好基础。为了验证五重 PCR 体系的扩增效果，还用 15 种弧菌 DNA 模板进行扩增，结果如图 3 所示，PCR 产物中仅扩增到在反应体系中加入的弧菌 DNA 相对应的条带，表明五重 PCR反应体系具有很好的特异性。用了Promega 公司的产品，且缓冲液中不含有电泳上样缓冲液。在选定各组合引物用量的基础上，对Go Taq DNA聚合酶和dNTP 的用量也进行了多次优化，最后确定了合适的用量，建立的多重 PCR 反应体系均能很好地扩增出相应的条带。图4 是部分MPCR-DHPLC 的检测结果，峰值大小与预期的基本吻合，各峰分离清楚，无其他峰产生，表明建立的 MPCR-DHPLC 检测方法是可行。2.3PCR-DHPLC 检测灵敏度的测定结果DHPLC 图谱中峰面积与 PCR 产物的量成正比。以平时检测较多的霍乱弧菌、溶藻弧菌和副溶血性弧菌为12342.2MPCR-DHPLC 方法的建立DHPLC 对 PCR 产物纯度要求较高，除要求使用纯度高的 DNA 外，对 DNA 聚合酶的要求也较高，因此选503分析检测食品科学2008,Vol.29,No.101.103CFU/ml；2.102CFU/ml；3.35CFU/ml V.c+37CFU/ml V.p；4.3CFU/ml。图5 霍乱弧菌和副溶血性弧菌二重PCR-DHPLC灵敏度测定结果Fig.5 Results of duplex PCR-DHPLC detection sensitivity ofV.cholerae and V.parahaemolyticus100165mV时间(min)10403134232300379100165mV时间(min)10404263301345100165mV时间(min)10406100mV时间(min)1020100236mV时间(min)104172151901701441272522642702913363651.103 CFU/ml；2.102 CFU/ml；3.52 CFU/ml V.a+37 CFU/ml V.p；4.5 CFU/ml V.a+3 CFU/ml V.p。图6 溶藻弧菌和副溶血性弧菌二重PCR-DHPLC灵敏度测定结果Fig.6 Results of duplex PCR-DHPLC detection sensitivity of V.alginolyticus and V.parahaemolyticus20100mV时间(min)1023742120100mV时间(min)1023742121720100mV时间(min)107375例，对霍乱弧菌和副溶血性弧菌、溶藻弧菌和副溶血性弧菌间的二重 PCR-DHPLC 检测灵敏度进行了测定，结果如图 5、6 所示。随着菌含量的减少，DHPLC 结果显示的特异峰的面积越来越小，霍乱弧菌和副溶血性弧菌的二重 PCR-DHPLC 最低能检测到 35CFU/ml 霍乱弧菌和 37CFU/ml 副溶血性弧菌，溶藻弧菌和副溶血性弧菌的二重 PCR-DHPLC 最低能检测到 52CFU/ml 溶藻弧菌和 37CFU/ml 副溶血性弧菌，即灵敏度完全均可达到100CFU/ml，这与各弧菌单一 PCR-凝胶电泳检测的灵敏度6相同。2.4弧菌 MPCR-DHPLC 检测方法的实际应用结果应用建立的MPCR-DHPLC方法用于本实验室2008年45 月的送检海产品中弧菌的检测，共检测 64 份样品，包括鱿鱼及其加工产品、虾仁、黑鲳、午鱼、鱼肚、鱼鳍、鲨鱼肉、鲣鱼、金枪鱼、秋刀鱼和带鱼等，63 份要求同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌，1 份要求同时检测副溶血性弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌，结果均为阴性，这与同时用传统微生物检验方法得到的结果一 致。3讨 论任何一个新的反应体系的建立，对它的优化是非常重要的，否则可能会出现假阳性、假阴性，出现非特异性条带、片状拖带或涂抹带等各种现象。引物浓度比例、退火温度等都影响多重 PCR 的成败7。本实验中，各引物的退火温度相同6，PCR 产物的大小相差较大，易于分离，因此需要优化的最主要因素就是各引物浓度的比例，也即相同浓度时的不同体积。研究表明，多重 PCR 反应体系中扩增片段的大小和所用引物浓度几乎成正比例，即片段大的，引物浓度要高8。而本实验经过多次优化确定的引物浓度结果表明并不完全符合这一规律，这更证明每建立一个 MPCR 组合均要进行实际的优化过程。由于在海(水)产品检测中，经常是一份样品同时检测几种致病性弧菌，因此有必要研究一种可同时、快12341234 2008,Vol.29,No.10食品科学分析检测504速检测多种致病性弧菌的方法。目前快速检测病原菌的主要方法是 PCR，但传统的 PCR 方法一次只能检测一种致病菌。MPCR 方法近年来也在弧菌的检测上得到应用，在一个 PCR 管中同时扩增多种弧菌，但都是用凝胶电泳法检测其产物。DHPLC 是一种用于快速、自动和高通量检测核酸的先进技术，可以对单链和双链核酸进行快速、准确、自动化地分离、分析和定量。本实验首次将 MPCR 与 DHPLC 技术联用，用于食品中多种弧菌的同时检测。采用多重 PCR 检测食品中 25 种致病性弧菌，然后利用 DHPLC 技术，一次可以自动分析数百个样品，可减少工作量，缩短检测时间，提高检测准确率，达到快速、高通量检测食品中致病性弧菌的要求。这样，可在不影响检出率的条件下加快检测速度、减少工作量和检测成本，以适应加入 WTO 后的新形势的需求。MPCR-DHPLC 检测方法与传统微生物检验方法以及 MPCR-凝胶电泳法相比，具有快速、高通量等优点，在致病菌检测上具有很好的应用价值。参考文献：1PINTO D A,CICCARESE G,TANTILLO G,et al.A collagenase-targeted multiplex PCR assay for identification of Vibrio alginolyticus,Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus J.J Food Prot,2005,68(1):150-153.2BAUER A,RORVIK L M.A novel multiplex PCR for the identificationof Vibrio parahaemolyticus,Vibrio cholerae and Vibrio vulnificusJ.Lett Appl Microbiol,2007,45(4):371-375.3蒋鲁岩.用复合 PCR 同步检测食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌及创伤弧菌J.检验检疫科学,2000,10(6):4,5-7.4许龙岩,周宏斌,覃文,等.多重 PCR 检测食品中霍乱弧菌和副溶血弧菌的研究J.检验检疫科学,2004,14(3):48-50;53.5贺晓龙.霍乱弧菌及副溶血弧菌复合 PCR检测方法的建立J.青海大学学报:自然科学版,2006,24(2):59-61.6吕海沧.食品中五种主要的致病性弧菌的PCR检测方法研究D.福州:福建农林大学,2007.7黄银花,胡晓湘,徐慰倬,等.影响多重 PCR 扩增效果的因素J.遗传,2003,25(1):65-68.8谢芝勋,谢志勤,庞耀珊,等.应用三重聚合酶链反应同时检测鉴别鸡3种病毒性呼吸道传染病的研究J.中国兽医科技,2001,31(1):11-14.