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PCR室菜鸟培训手册
实时荧光定量PCR的定量方法有两种：一种是绝对定量；另一种是相对定量。
①绝对定量：就是我们分子室每天做的工作（HBV,HCV,CT/UU/TB/HSV…），绝对定量的测定结果准确，但需要目的片段的标准品，通过绘制标准曲线来计算出测定结果。
②相对定量：（在通常情况下，并没有目的片段的标准品，为了计算出一个值，就必须采取相对
2、定量的方法，这也是实验研究常采取的方法之一）。相对定量需要借助一个内参基因（像β-action，GAPDH…起空白的作用）作比对，以间接计算出目的基因的测定值。其计算公式如下：
△Ct=Ct（目的基因）-Ct（管家基因）
△△Ct=△Ct（实验组）-Ct（对照组）
相对表达量=2-△△Ct
PCR结束后，一个良好的扩增曲线会有如下特征：
①曲线拐点清楚，特别是低浓度样本曲线指数期亦明显；
②扩增曲线整体平行性好，其平行性一定程度上反应定量结果的重复性好坏；
③基线平直或略微下降，无明显上扬趋势，阴阳分界清楚；
④扩增曲线整体平行性好，表明各管扩增效率相近，曲线越上扬明显，表
3、明扩增效率越好。
PCR基本术语和概念（以绝对定量为例）：
Baseline（基线）：PCR最初几个循环的荧光值作背景值。
Threshold（阈值）：一条人为设定在PCR指数增长期的直线。
Ct值：每条荧光扩增曲线与所设定的阈值（Threshold）相交时对应的循环次数。
(为什么选择Ct值作为样本浓度的原始数据呢？因为理论研究表明：各模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。)
Slope（斜率）：反应标准曲线距离的远近，若标准品以10倍为一梯度，值一般≈3.32。
Intercept（截距）：假设循环次数为40次，按标准曲线制作方程后，可以算出，当
4、拷贝数为1个拷贝时，理论上应在第40个循环抬头并与阈值相交，这里的40就是理论上的Intercept截距（Intercept）。但扩增效率是不可能没有损失的，实际中截距一般在43-46左右。
相关系数（R2）：曲线拟合的准确度，值越接近1越好，一般》0.99。
理论上，PCR每一个循环会将底物的拷贝数翻一倍，每3.32个循环会将原拷贝数翻10倍，其扩增后浓度与扩增前浓度的计算公式如下：
C原浓度×2n=C新浓度
实际工作中，PCR定标后常常会遇到如下情况，要会分析，并校准结果：
①Intercept（截距）偏大，标准曲线整体后移，造成结果均偏大；
②Intercept（截距）偏小，
5、标准曲线整体前移，造成结果均偏小；
③Slope（斜率）偏大，标准曲线整体散开，造成结果大的偏小，小的偏大；
④Slope（斜率）偏小，标准曲线整体紧缩，造成结果大的偏大，小的偏小；
（下述4种情况照成的影响并不确定，文字仅作参考）
⑤Intercept（截距）偏大，而Slope（斜率）偏小，造成结果大的严重偏大，小的影响略微抵消；
⑥Intercept（截距）偏小，而Slope（斜率）偏大，造成结果大的严重偏小，小的影响略微抵消；
⑦Intercept（截距）偏大，而Slope（斜率）偏大，造成结果大的影响略微抵消，小的严重偏大；
⑧Intercept（截距）偏小，而Slope（斜率）偏小，造成结果大的影响略微抵消，小的严重偏小。
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