滋阴潜阳方对自发性高血压大鼠心肌纤维化相关蛋白表达的影响.pdf

滋阴潜阳方对自发性高血压大鼠心肌纤维化相关蛋白表达的影响王奇林，董昌武，徐慧，刘阳，李茜，宋敏（安徽中医药大学，安徽 合肥 ）摘要 目的观察滋阴潜阳方对自发性高血压大鼠心肌纤维化的作用及其机制。方法将 只雄性自发性高血压大鼠随机分为模型组，依那普利组，滋阴潜阳方高、低剂量组，每组 只，另取 只 雄性大鼠作为正常组。各给药组分别每日次、连续灌胃周给予相应药物；记录各组大鼠血压值，染色观察大鼠心肌组织病理变化，法检测大鼠心肌组织结缔组织生长因子（，）、型胶原蛋白（，）、平滑肌肌动蛋白（，）表达水平，法检测大鼠心肌组织 、表达水平。结果与模型组比较，滋阴潜阳方高、低剂量组及依那普利组大鼠收缩压均显著降低（犘 ）；滋阴潜阳方高剂量组与依那普利组大鼠心肌组织蓝色心肌胶原纤维明显减少；滋阴潜阳方高剂量组和依那普利组大鼠心肌组织 、蛋白及 表达水平均明显降低（犘 ）。结论滋阴潜阳方能够降低自发性高血压大鼠的血压并抑制其心肌纤维化，其作用机制可能与其抑制心肌成纤维细胞的增殖、转分化有关。关键词 自发性高血压；滋阴潜阳方；平滑肌肌动蛋白；结缔组织生长因子；型胶原蛋白 中图分类号 自发性高血压是一种由多种因素引起的血压升高的全身性疾病，是心脑血管疾病最主要的诱发因素，可对多个重要脏器造成损害，如心、脑、肾，并可最终导致这些脏器衰竭 。高血压病引起的心肌病变是导致心脏受损的主要因素，中国每年约有 万患有高血压病的个体发生心功能损伤，其中自发性高血压约占。目前，自发性高血压的治疗方式主要使用一线降压药控制血压，如临床常用钙离子拮抗剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂等，用药时间几乎贯穿整个发病过程，长时间的高血压状态所产生的并发症对机体造成的伤害远大于高血压本身。中药治疗自发性高血压有降压后不易反弹的优势。因此，寻找行之有效的中药治法或中西药结合治法将有助于降低高血压及其并发症对人体的损害。自发性高血压损伤心脏的主要方式是心室重构，心室重构最主要的病理变化是心肌纤维化，故预防心肌纤维化是防治自发性高血压并发症的一个重要方向。研究 显示，心肌纤维细胞的增殖、转分化在心肌纤维化中具有重要作用，在转分化的心肌成纤维细胞内可进一步激活结缔组织生长因子（基金项目：安徽高等学校自然科学研究项目（）作者简介：王奇林（），男，硕士研究生通信作者：董 昌 武（），男，博 士，教 授，）、型 胶 原 蛋 白（，）、平滑肌肌动蛋白（，）等心肌纤维化的相关因子，从而导致心肌纤维化的发生发展。滋阴潜阳方是临床治疗自发性高血压的有效方，其主要由龟板、石决明、煅牡蛎、制何首乌、钩藤、熟地黄、生地黄、川芎等组成。前期研究发现，滋阴潜阳方具有改善“两肾一夹”高血压大鼠左心室重构的作用，但其对心肌纤维化的影响机制尚未明确。本研究建立自发性高血压大鼠模型，观察滋阴潜阳方对自发性高血压大鼠左心室重构的改善作用并探究其抑制心肌纤维化的机制。材料 动物清洁级雄性自发性高血压大鼠 只，周龄，体质量为（），级 雄性大鼠 只，体质量为（）。所有动物均购自维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：（京）。所有大鼠均饲养于安徽省医学 科 学 研 究院 动 物 实 验 中 心，室 温 为（），湿度控制为（），光暗循环。本研究由 安 徽 中 医 药 大 学 伦 理委 员 会 批 准，证 明 号：。药物滋阴潜阳方药物组成：龟板、石决明（先煎）、煅牡蛎（先煎）各，制何首乌、钩藤（后下）各，熟地黄、生地黄、川芎各，以上药物均购自安徽中医药大学第一附属医院中药房。煎煮方法：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 连续次煎药，取次过滤液，再置于低温恒温水浴中浓缩至含生药质量浓度为，药液装瓶，存储。依那普利（江苏制药股份有限公司生产，国药准字号 ，每片 ），购自安徽中医药大学第一附属医院西药房。仪器大鼠无创血压测量系统（）：上海玉研科学仪器有限公司；电泳仪（型号 ）、电泳槽（型号 ）、转膜仪（型号 ）：上海天能科技有 限 公 司；高 速 冷 冻 离 心 机（型 号 ）：安徽嘉文仪器装备有限公司；荧光定量 仪（型号 ）：。试剂 抗体（批号 ）、抗体（批号 ）、抗体（批号 ）：；（批 号 ）：；膜（批号 ）：；反转录试剂盒（批号 ）：。方法 动物分组及给药根据 实验动物学，以大鼠收缩压高于 判定为高血压模型复制成功；以性情易激惹、饮水量增加判定大鼠证型为阴虚阳亢；综合以上标准，判断自发性高血压大鼠是否符合阴虚阳亢型高血压模型。将 只符合模型标准的自发性高血压大鼠随机分为模型组，滋阴潜阳方高、低剂量组，依那普利组，每组 只，另取 只 大鼠作为正常组。模型组和正常组大鼠每日给予 溶液 灌胃。根据 实验动物学 中常用实验动物与人的体表面积比例换算方法，依那普利组给予依那普利 （），滋阴潜阳方低、高剂量组分别给予大鼠 、（）（分别相当于成人临床用药的等效剂量、倍剂量）滋阴潜阳方汤剂灌胃，每日次，连续给药周。血压测量用无创血压采集系统分别测量各组大鼠尾动脉收缩压次，依次为给药前，给药、周后。每次每只大鼠测量次，取平均值。取材药物干预周后，用 乌拉坦对大鼠进行腹腔注射麻醉。迅速处死大鼠，开胸，取出心脏。一部分心肌组织用预冷的生理盐水冲洗残留血液后固定于多聚甲醛溶液中，后进行组织脱水、包埋及切片处理。另一部分心肌组织用 洗涤血液后，用组织剪剪成小拇指指甲盖大小的小块，液氮速冻后保存于 冰箱中备用。染色观察大鼠心肌纤维化情况心肌组织切片后脱蜡至水，进行苏木精伊红（，）染色。显微镜下观察各组切片染色情况，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色，随机选取个视野留取图像进行分析。法检测大鼠心肌组织 、及 蛋白表达水平每组各取只大鼠左心室组织样本 ，加入 细胞裂解液 （内含 ）进行裂解。离心 ，收集上清液，即为总蛋白液。在 胶中电泳，电 泳 结 束 后 转 印 到 膜，转印结束后将 膜放入 封闭液（脱脂奶粉）中封闭。按照合适的比例用一抗稀释液进行稀释，缓慢摇动孵育过夜。加入 ，每次洗涤 ，共洗涤次。洗膜结束后用二抗室温孵育，洗涤液将条带放入 显影液，用凝胶图像处理系统分析条带，以目的蛋白灰度值与 内 参 蛋 白 灰 度 值 的 比 值 作 为 蛋 白 相 对 表达量。法检测大鼠心肌组织 、及 表达水平每组各取只大鼠左心室组织 ，加入 裂解。待裂解完全后室温放置 。离心 ，取上清液，加入适量无水乙醇。混匀后加入到 提取柱中，依次加入反应液，提取总 溶液，测定总 浓度及纯度后逆转录，即为 。以 为模板进行 检测，以正常组为参照组，为内参，以 法计算各组大鼠心肌组织 、及 的表达量。引物合成序列见表。表 、引物合成序列基因引物序列（）引物长度 上游：下游：上游：下游：上游：下游：上游：下游：统计学方法采用 统计软件进行数据分析。计量数据以“均数标准差（珚狓狊）”表示。符合正态分布的计量数据多样本间均数比较采用单因素方差分析，均数多重比较采用 检验（方差齐时）或 犜检验（方差不齐时）；不符合正态分布的数据，采用非参数检验。犘 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 表示差异有统计学意义。结果 各组大鼠收缩压比较与正常组比较，各时点各组大鼠尾部收缩压显著升高（犘 ），表明模型复制成功；模型组大鼠收缩压随时间而逐渐升高。与模型组比较，给药周后依那普利组与滋阴潜阳方高剂量组大鼠收缩压均显著降低（犘 ），其中滋阴潜阳方高剂量组收缩压降低更明显（犘 ）；与模型组比较，给药、周后依那普利组，滋阴潜阳方高、低剂量组大鼠收缩压均显著降低（犘 ），其中以滋阴潜阳方高剂量组降低作用最明显，依那普利组次之（犘 ）。见表。表各组大鼠收缩压比较（珚狓狊）组别狀收缩压 给药前给药周后给药周后给药周后正常 模型 滋阴潜阳方高剂量 滋阴潜阳方低剂量 依那普利 注：与正常组比较，犘 ；与模型组比较，犘 ；与依那普利组比较，犘 ；与滋阴潜阳方高剂量组比较，犘 各组大鼠心肌组织纤维化情况比较模型组大鼠心肌组织可见大量蓝色心肌胶原纤维增生，心肌纤维化明显；与模型组相比，滋阴潜阳方高剂量组与依那普利组大鼠心肌组织蓝色心肌胶原纤维明显减少，而滋阴潜阳方低剂量组大鼠心肌组织仍可见大量蓝色心肌胶原纤维增生。见图。注：正常组；模型组；滋阴潜阳方高剂量组；滋阴潜阳方低剂量组；依那普利组图各组大鼠心肌组织纤维化情况比较（染色，倍）各组大鼠心肌组织 、蛋白及 表达水平比较与正常组比较，模型组大鼠心肌组织 、蛋白及 表达水平均升高（犘 ）；与模型组比较，滋阴潜阳 方 高 剂 量 组 和 依 那 普 利 组 大 鼠 心 肌 组 织 、蛋白及 表达水平均显著降低（犘 ）。见表、表、图。讨论研究 表明，中医药在治疗高血压病及其并发症方面确有良好疗效。自发性高血压属中医学“眩晕”“头痛”等范畴，由多种内外因素相互影响而成，中医认为，本病的病机以阴虚为主，尤以心、肝、肾三脏阴虚所致。肝肾阴虚致阳亢难制，肾水不足亦导致心阴不足、心肾不交，长期心阴不足造成心气亏虚甚或心阳不振，导致水湿甚或瘀血的产生，水湿、瘀血内阻则导致疾病发展及加重。本病病位在心，常累及肝、肾、脾、肺等脏器，临床治疗多采用滋阴、潜阳、祛湿、活血等方法。高尔鑫教授根据本病的病因病机，创制具有滋阴潜阳作用的中药复方滋阴潜阳方，该方是在镇肝息风汤和天麻钩藤饮的基础上化裁而来，临床用于治疗自发性高血压疗效良好 。滋阴潜阳方通过益阴补血、祛瘀通络改善自发性高血压造成的心脏损伤。方中重用龟板、生地黄、熟地黄滋养肝肾之阴，加入钩藤降压作用良好；石决明、牡蛎两药重镇潜阳，川芎活血祛瘀通络，针对本病本虚标实之病机。诸药共奏滋阴潜阳之功，从而有效治疗阴虚阳亢型高血压。自发性高血压所致心肌纤维化的临床症状可表现为心胸憋闷、疼痛，并伴有头晕或头痛。憋闷、疼痛多为血行不畅所致，阴血同源，长期心肾不交导致心血不足，滋阴潜阳方中用牡蛎、龟板两药补心血之亏兼养心神，再加生地黄、熟 地 黄 两 药 以 滋 肾 阴，共 奏 滋 养 心 肾 之 功；：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 表各组大鼠心肌组织 、蛋白表达水平比较（珚狓狊）组别狀 正常 模型 滋阴潜阳方高剂量 滋阴潜阳方低剂量 依那普利 注：与正常组比较，犘 ；与模型组比较，犘 表各组大鼠心肌组织 、表达水平比较（珚狓狊）组别狀 正常 模型 滋阴潜阳方高剂量 滋阴潜阳方低剂量 依那普利 注：与正常组比较，犘 ；与模型组比较，犘 注：正常 组；模 型 组；滋 阴 潜 阳 方 高 剂 量 组；滋阴潜阳方低剂量组；依那普利组图各组大鼠心肌组织 、蛋白表达电泳图头晕、头痛多为阳亢难制所致，方中钩藤制风、川芎活血祛瘀通络。诸药共用，标本兼治，故药味虽少，疗效颇佳。滋阴潜阳方可有效改善自发性高血压所致心肌纤维化。心肌纤维化主要表现为胶原沉积、比例失调并伴有心肌成纤维细胞的增生。血管紧张素、醛固酮等促成高血压的因子可促进心肌成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，导致胶原蛋白被大量合成，从而导致和加重心肌纤维化。是肌成纤维细胞活化的标志性蛋白，肌成纤维细胞可大量合成 ，导致胶原代谢异常。作为促成纤维细胞分裂和胶原沉积的细胞因子，可介导血管紧张素、转化生长因子的部分生物效应，从而刺激心肌成纤维细胞增殖和细胞外胶原的沉积，在促进纤维化方面发挥重要作用。本研究结果显示，滋阴潜阳方具有降低自发性高血压大鼠收缩压的功效，随着给药时间的延长，大鼠的收缩压呈持续降低状况，与前期实验结果一致。滋阴潜阳方高剂量组和依那普利组可明显降低自发性高血压大鼠的收缩压（犘 ），而低剂量组降压作用不明显。滋阴潜阳方高剂量组和依那普利组可明显降低自发性高血压大鼠心肌组织中 、蛋 白 及 表 达 水 平（犘 ），而低剂量组作用不明显。综上，滋阴潜阳方可能通过抑制心肌成纤维细胞的增殖和转分化等过程，抑制自发性高血压大鼠心肌纤维化的发展，其作用途径有待进一步研究。参考文献：徐兴华，俞晓英，金华，等镇肝熄风汤对自发性高血压大鼠血压及盲肠结肠肠道菌群的影响中药药理与临床，（）：姚佳梅，杨海燕，杨玉书，等天麻钩藤饮调控 表达干预自发性高血压病模型大鼠血管衰老的作用机制中国中药杂志，（）：吴超群，李希，路甲鹏，等中国居民心血管疾病危险因素分布报告中国循环杂志，（）：王柄茜，顾宁中医药干预急性心肌梗死后心室重构的研究进展与展望 中 华 中医 药 学刊，（）：，（）：，（）：王振涛，边汝涛，杨凤鸣，等抗纤益心方对扩张型心肌病大鼠心肌纤维化相关蛋白表达的影响中国中医 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 基础医学杂志，（）：刘阳，董昌武，徐慧，等基于 通路探讨滋阴潜阳方改善自发性高血压大鼠肾损害的机制安徽中医药大学学报，（）：程斌基于 通路探讨滋阴潜阳方对 高血压大鼠心肌重构的影响机制研究合肥：安徽中医药大学，秦川实验动物学北京：人民卫生出版社，：魏伟药理实验方法学北京：人民卫生出版社，：张晓英，王秀，李艳，等滋阴潜阳法治疗高血压中医学报，（）：张晓英，李艳，王秀，等滋阴潜阳方辨证加味联合氯沙坦治疗原发性高血压伴血脂异常临床观察安徽中医药大学学报，（）：金建宁，楚国庆，李建红，等滋阴潜阳降压方治疗初发高血压病疗效观察时珍国医国药，（）：董蓉蓉，李敏，荆鲁镇肝熄风汤治疗原发性高血压的临床及机制研究进展中国实验方剂学杂志，（）：徐慧，董昌武天麻钩藤饮联合针刺对自发性高血压大鼠的降压作用及机制研究中西医结合心脑血管病杂志，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：（收稿日期：）犈 犳 犳 犲 犮 狋 狅 犳犣 犻 狔 犻 狀犙 犻 犪 狀 狔 犪 狀 犵犘 狉 犲 狊 犮 狉 犻 狆 狋 犻 狅 狀狅 狀狋 犺 犲犈 狓 狆 狉 犲 狊 狊 犻 狅 狀狅 犳犕 狔 狅 犮 犪 狉 犱 犻 犪 犾犉 犻 犫 狉 狅 狊 犻 狊 狉 犲 犾 犪 狋 犲 犱犘 狉 狅 狋 犲 犻 狀 狊犻 狀犛 狆 狅 狀 狋 犪 狀 犲 狅 狌 狊 犾 狔犎 狔 狆 犲 狉 狋 犲 狀 狊 犻 狏 犲犚 犪 狋 狊 ，（，）犃 犫 狊 狋 狉 犪 犮 狋犗 犫 犼 犲 犮 狋 犻 狏 犲 （）犕 犲 狋 犺 狅 犱 狊 ，；（），（），（），犚 犲 狊 狌 犾 狋 狊 ，（犘 ），（犘 ）犆 狅 狀 犮 犾 狌 狊 犻 狅 狀 ，犓 犲 狔狑 狅 狉 犾 犱 狊 ；：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月