致犊牛腹泻大肠杆菌的分离培养与药敏试验_思汗.pdf

通信作者，：收稿日期：；修回日期：作者简介：思汗（），男（蒙古族），内蒙古呼伦贝尔市人，硕士，副研究员，研究方向为动物疫病防控，：文章编号：（）致犊牛腹泻大肠杆菌的分离培养与药敏试验思汗，哈日巴拉，郝剑峰，（内蒙古呼伦贝尔市动物疫病预防控制中心，内蒙古呼伦贝尔 ；内蒙古自治区动物疫病预防控制中心，内蒙古呼和浩特 ）摘要：为进一步探讨防止犊牛顽固性腹泻的防治方案，根据某养殖场的发病案例，采用细菌分离法分离病料中的大肠杆菌，明确大肠杆菌的致病性，并采用纸片扩散法进行了大肠杆菌的药敏试验，筛选敏感药物。结果表明，案例中共分离到 株致病性大肠杆菌；不同的大肠杆菌菌株对药物的敏感性存在一定差异；以上的菌株对头孢噻吩、环丙沙星、恩诺沙星、左氧氟沙星高敏，左右的菌株对氨苄西林、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素高敏，左右的菌株对复方新诺明和红霉素中敏，的菌株对四环素、链霉素耐药。因此，在控制疫病的过程中，必须对病因进行准确诊断，并进行严格的药敏实验，以确定敏感性的药品，再进行有针对性的治疗。关键词：犊牛；顽固性腹泻；病原鉴定；防治方案中图分类号：；文献标志码：目前，我国奶牛养殖规模持续扩大，促进了很多地区经济的发展，但各种传染病也日趋复杂化。腹泻是牛养殖期间比较常见的传染病，其病因复杂，主要致病性因素包括养殖管理因素、营养因素和传染性因素等。犊牛出生后，胃肠道的消化功能相对较差，自身抵御多种病原的能力不足，如养殖环境差或饲料营养价值较差，不能够及时吃上和吃足初乳，造成牛群的胃肠道消化功能异常，就会给各种病原微生物的入侵提供条件，最终引发严重的腹泻现象。从现阶段犊牛腹泻的发生及流行情况来看，顽固性腹泻的发生流行率逐年升高，犊牛的发病周期延长，药物的治疗效果变差，病情不稳定，治疗周期较长，经济损失巨大，且很难彻底根除病情，经常会周期性的传播流行。要想更好地防治犊牛顽固性腹泻，必须对发病原因进行有效探讨，并加强致病原的分离鉴定，掌握引发顽固性腹泻的原因，从病原鉴定、药敏试验入手，在最短的时间内有效控制病情，可防止出现更大的危害。试验材料与方法发病现状某肉牛养殖场共养殖肉牛 头，年 月下旬开始养殖场的犊牛群体中陆续出现以腹泻症状为主的传染性疾病，不同年龄的犊牛发病严重程度存在一定的差异性，年龄越小的牛群发病症状越严重。发病后，养殖户将患病牛单独隔离，使用青霉素、链霉素等抗生素联合用药，初期有一定效果，但病情不能够彻底根治，一旦停药病情就会加重，犊牛的发病周期较长，普遍在周。兽医进行了病料采集，收集了 只牛只的排泄物，并将其送到实验室进行病原学分析。试验方法大肠杆菌分离鉴定将采集到的患病牛新鲜粪便进行病原鉴定，使用革兰氏染色剂进行涂片染色检查并观察。将收集的粪样分别用常规琼脂平板、麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板进行接种试验，放置在培养箱中 培养 ，观察培养平板细菌的生长情况。将分离到的疑似菌落接种到肉汤当中，持续培养 观察肉汤的变化情况。生化鉴定将分离菌株的纯培养物接种到生化鉴定管中，放置在 恒温箱中持续培养 ，观察各生化管的反应。致病性试验选择只小白鼠，根据随机性的原理，将其分为实验组和对照组。试验组的小白鼠每只腹腔注射分离到的纯 培 养 物 ，对 照组 小 白鼠 腹腔注射 的无菌生理盐水，观察注射后试验组和对照组小白鼠的生存情况，进一步判定分离菌的致病性。药敏试验将有大肠杆菌生长的营养肉汤用灭菌生理盐水 年月第期兽医导刊 稀释，使稀释液的浑浊度在比浊管范围中。将消毒棉棒插进一种经过稀释的常规肉汤中，用棉花棒顺管子的边缘滚动，去掉多余的液体，涂布于烘干好的营养琼脂平板上，接着将其转 ，将整个板涂上一层大肠埃希氏菌，然后用灭菌镊子将含有抗生素片的药敏片放置在平板中轻轻按压，每个平板上贴个纸片，放置在 恒温箱中持续培养 ，观察抑菌圈的直径。本药敏试验的抗生素为氨苄青霉素、氧氟沙星、妥布霉素、头孢噻吩、链霉素、恩诺沙星、先锋必、先锋噻肟、庆大霉素、环丙沙星、先锋、苯唑青霉素、氯霉素、阿米卡星、头孢拉定、复方新诺明、氧哌嗪青霉素、卡纳霉素、万古霉素、四环素、氟哌酸、红霉素。抗原血清鉴定选取纯培养物将其制作成浓稠的菌悬液，放置在 高温环境下高压 破坏抗原。使用接种环蘸取菌悬液和稀释 倍的 型抗原血清，在玻璃板上混合菌液，如果在 内出现了明显的凝集，可以判定为阳性。结果病原分离鉴定结果采集到的粪便可以在一般的营养琼脂板上发育出中等的、大的、圆的、中心凸出的，边缘较为平整，潮湿而平滑，灰色的病原菌，一般为，半透明。病原菌能够在血液琼脂平板上良好生长，菌落大小中等；在麦康凯琼脂平板上会产生中等大小、粉红色的致病菌，菌落边缘整齐，呈现露珠状（图）；在伊红美蓝琼脂平板上能够形成黑色带有金属光泽的致病菌菌落。将分离到细菌注入到正常的肉汤培养基中，可以让肉汤变得混沌，并且会有一些细小的白色的沉淀。经染色镜观察可见革兰氏阴性染色的中等大小短棒杆菌，两端钝圆型，成对或单独出现，无芽胞，有小的包膜，两极性染色较为显著（图）。综合以上临床特点，尤其是各个培养平板上的典型菌落特征，可以判定病原为大肠杆菌。生化鉴定结果本次研究共分离到 株大肠杆菌，生物化学分析表明提取出来的大肠杆菌可以很好地发酵葡萄糖、麦芽糖和乳糖，并且在发酵过程中会产生酸和气体，有部分菌株不会发酵蔗糖，但分离得到的大肠杆菌不会生成硫化氢，不会分解尿素，也不会利用柠檬酸盐。通过硝酸还原实验可以看到，反应为阳性，吲图麦康凯琼脂平板上菌落形态 图大肠杆菌革兰氏染色镜检形态 .哚、甲基红阳性，实验为阴性，根据以上的生物化学鉴别，可以判定分离的菌株为大肠杆菌。动物致病性试验将分离得到的培养物接种到小白鼠体内，结果接种的小白鼠在接种 后就会死亡，而对照组小白鼠没有出现死亡现象。死亡的小白鼠在临死之前表现为精神状态逐渐变差，背毛杂乱，尾巴和腹部出现发绀现象，不能正常采食，四肢僵硬，最终死亡。通过对死亡小白鼠解剖处理，发现病死小白鼠肺脏组织存在出血点，肝脏、脾脏存在不同程度的炎症，病变表面存在点状出血，尤其是小白鼠的肝周炎症状较为明显。采集病灶进行染色镜检发现革兰氏阴性染色的短棒杆菌，中等大小。小白鼠脏器组织中分离到的病原和犊牛粪便中分离到的病原一致，由此判定从犊牛粪便中分离到的大肠杆菌具有致病性。药敏试验通过药敏试验能够看到，以上分离到的菌兽医导刊 年第期株对头孢噻吩、环丙沙星、恩诺沙星以及氧氟沙星高敏；左右分离到的菌株对庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素高敏；左右的菌株对复方新诺明和红霉素中敏；以上的菌株对四环素、链霉素耐药；所有分离到的大肠杆菌菌株对林可霉素、利福平以及青霉素等抗生素耐药。详细情况如表所示。表药敏试验结果（）（）抗生素 耐药 中敏 高敏 氨苄青霉素 氧氟沙星 妥布霉素 头孢噻吩 链霉素 恩诺沙星 先锋必 先锋噻肟 庆大霉素 环丙沙星 先锋 苯唑青霉素 氯霉素 阿米卡星 头孢拉定 复方新诺明 氧哌嗪青霉素 卡那霉素 万古霉素 四环素 氟哌酸 红霉素 型抗原血清鉴定抗原血清鉴定表明，分离到的 株大肠杆菌中共确定了 个血清型，存在部分菌株混合感染现象。根据 型抗原凝集效价，从 株菌株当中筛选的 种 血 型 分 别 是 、。其中，优势的致病性大肠杆菌是 、，属于产毒素的大肠杆菌，属于产志贺毒素的大肠杆菌。由于大肠杆菌的抗原血型种类多样，犊牛生长阶段受到多种血清型混合感染，导致药物的防治效果逐渐变差，发病周期较长，形成了顽固性腹泻，对牛群的生长发育构成了严重危胁。讨论治疗方案近年来，随着牛养殖业不断发展，犊牛大肠杆菌所引发的顽固性腹泻数量呈逐渐增多的态势，在某些地方其患病率可达，致死率能够达到。从本次调查结果可以看出，患病犊牛的粪便中筛选出了 株大肠杆菌，不同大肠杆菌拥有不同血清型，而且随着时间的推移，大部分的细菌都会对常见的抗生素产生抗性，从而导致药物的控制作用越来越弱。因此，在进行临床治疗时，必须进行药物检测，确定大肠杆菌的血清学类型，并选择相应的抗菌药物，保障防治的针对性。另外，在服用药物的时候要注意轮流给药，不要长期服用同一种药物，也不要大范围多品种的联合应用。在明确大肠杆菌感染引发的顽固性腹泻之后，结合药敏试验对养殖场的患病牛进行针对性治疗。本试验选择使用恩诺沙星和环丙沙星交替注射治疗，上述两种药物的使用剂量分别为 体重和 体重，每天用药两次，连续用药；同时，使用复方黄芪多糖注射液进行辅助治疗，按照 体重进行肌肉注射，连续使用；将胃蛋白酶 、酵母粉 、稀盐酸 、温水 混合，犊牛每次服用 ，每天服用次，连续使用，增强胃肠道的消化功能，抑制大肠杆菌的繁殖复制。对于存在脱水或者酸中毒的牛群，可以使用葡萄糖生理盐水注射液 添加 维生素 ，与 安娜卡注射液 混合之后静脉注射，单一使用碳酸氢钠注射液 静脉注射，上述药物每天使用次，连用。在患病牛恢复期间，选择使用维生素按照比例添加到饲料当中，增强胃肠道的消化机能，提高身体免疫能力，加快犊牛恢复。按照上述方案治疗 后，以上的犊牛临床症状逐渐消退，能够正常生长，正常进食，有个别犊牛恢复健康之后，生长发育不良，停止生长，将其淘汰处理。预防措施基层养殖户的养殖管理水平不高，疫病防控意识不强，在一定程度上增加了顽固性腹泻的发生流行率，再加上养殖户的不规范药物使用行为，使得病原的耐药性显著增强，给致病性大肠杆菌的入侵，长时间繁殖生长产生毒素提供了条件。所以，在发展牛养殖产业时，除了要加强病原有效分离鉴定，进行严格药品试验之外，还需要结合其他引发犊牛腹泻疾病的原因构建针对性的预防方案，确保早发现早处理，在短时间内控制病情。预防大肠杆菌感染引发的顽固性腹泻应该注重加强对犊牛的针对性护理。要严格落实卫生消毒，并保障日常环境清洁健思汗哈日巴拉郝剑峰致犊牛腹泻大肠杆菌的分离培养与药敏试验康。母牛在生产阶段一定要做好后躯肢体、外阴乳头的消毒处理，推荐使用新洁尔灭进行消毒。助产人员的手臂用新洁尔灭进行消毒。犊牛出生之后应该做好断脐处理。犊牛的牛床以及运动场地应该定期清理，及时清除圈舍当中的粪便，使用氢氧化钠水溶液喷雾消毒。饲料槽、饮水槽和喂奶用的用具可以使用高锰酸钾消毒。日常要保证圈舍干燥整洁，卫生良好，营造温暖舒适的生长环境，预防应激刺激对犊牛消化道造成的不良影响。小结综上所述，犊牛顽固性腹泻的发生流行率较高，临床上表现为发病周期较长，多种药物治疗效果相对较差，引发犊牛出现严重的体液流失，牛群出现酸中毒，电解质紊乱失衡，严重的可以引发大面积的死亡。顽固性腹泻防控过程中，要明确具体的致病原，临床用药过程中，一定要坚持科学用药，合理用药，保证用药周期，避免大剂量、多种类的使用抗生素，降低病原耐药性的产生几率，并注重加强养殖管理，构建完善的预防措施，将顽固性腹泻的发生流行率降到最低。参考文献（）：方光远，张姝，樊婕，等犊牛腹泻大肠杆菌疫苗的研制与应用 中国奶牛，（）：梁红玉中西医结合治疗犊牛顽固性腹泻之我见兽医导刊，（）：郭沈涛，于辉，林旭埜，等犊牛病原性腹泻及疫苗研究进展中国畜牧兽医，（）：汪士龙 牛大肠杆菌腹泻疾病诊治 畜牧兽医科学（电子版），（）：陈小丽，孙娅莉 一株致犊牛冬季腹泻大肠杆菌的分离鉴定河南畜牧兽医（综合版），（）：吴中艳，覃杰犊牛大肠杆菌和沙门氏菌佐剂灭活疫苗的制备与临床效果观察当代畜禽养殖业，（）：，（.，；.，）：，：；兽医导刊 年第期