养正消积胶囊通过抑制PI3K_AKT_mTOR信号通路诱导肺腺癌细胞凋亡和自噬的作用研究.pdf

第 卷 第 期 年 月川北医学院学报(:/).:/基础研究基金项目:陕西省自然科学基础研究计划项目()作者简介:周菁()女硕士主治医师:.通讯作者:王佳:.养正消积胶囊通过抑制/信号通路诱导肺腺癌细胞凋亡和自噬的作用研究周菁王玉珍李丽娜郭亚焕史玉民焦咪段炼阎丽王佳(.陕西省肿瘤医院肿瘤内科.空军军医大学附属西京医院泌尿外科陕西 西安)【摘要】目的:探讨养正消积胶囊通过抑制/信号通路诱导肺腺癌细胞凋亡和自噬的作用机制 方法:通过中药系统药理学数据库与分析平台对养正消积胶囊重要的 个组分进行分析筛选有效化合物及与肺腺癌相关基因并对作用通路进行预测使用 法对养正消积胶囊成分进行提取后标记为 取对数生长期肺腺癌 细胞依据不同 浓度分为空白对照组、高()、中()、低浓度组()经药物干预 后 法检测细胞凋亡、自噬及/信号通路相关蛋白的表达水平变化 结果:与正常对照组相比 低、中、高浓度组中 细胞增殖能力、迁移、侵袭能力减弱凋亡率均增高且呈剂量依赖性 结果显示 细胞经 干预 后自噬标志蛋白、表达水平升高同时促进 向 转化(.)与对照组对比经 干预的各组 细胞中的、及 蛋白含量均降低加入 激活剂 后、表达均增多且、/的比值降低 结论:养正消积胶囊可能是通过下调 细胞中、磷酸化水平促进细胞自噬抑制/信号通路的促癌作用【关键词】养正消积胶囊/信号通路肺腺癌细胞凋亡自噬作用机制【中图分类号】.【文献标志码】/(.)【】:/.:.()()()./.:./.:/.【】/第 卷 第 期 年 月 川北医学院学报(:/).肺癌具有高发病率和高死亡率主要有非小细胞癌()和小细胞癌两种类型以 最为常见 患者主要为肺腺癌此类患者在疾病早期通常无典型表现但具有高转移潜能 调查发现在确诊为肺腺癌患者中的患者已进展为中晚期错失最佳治疗时机 通过手术、放疗、化疗、靶向、免疫等手段的应用晚期患者生存率提高有限 临床研究已证实中医在恶性肿瘤的临床治疗中具有安全性高、药物副作用小等突出优势 养正消积胶囊是一种由 味中药组方构成的方剂可从多种途径诱导肿瘤的凋亡和自噬进而抑制肿瘤的进展研究 发现/信号通路是调控细胞增殖、凋亡的重要通路 本课题组通过网络药理学相关数据库应用发现养正消积胶囊可能是通过/信号通路抑制肺腺癌的发展故对肺腺癌 细胞进行探究 材料与方法.材料人肺腺癌 细胞(中国科学院细胞库)取对数生长期细胞用于实验 养正消积胶囊购自石家庄以岭药业股份有限公司 高糖 培养基(美国 公司)胎牛血清(上海源叶生物科技有限公司)单克隆抗体(美国 公司)、单、克隆抗体(上海碧云天生物技术有限公司).主要仪器 型流式细胞仪(德国 公司)、型低温高速离心机(德国 公司)、型细胞培养箱(上海力申科学仪器公司)、型转膜仪、型电泳仪(均购于美国 公司)、型多功能酶标仪(美国 公司)、型垂直电泳槽(美国 公司).方法.养正消积胶囊化学成分及靶点预测中药系统药理学数据库与分析平台()中分别输入养正消积胶囊的主要成分黄芪、莪术、白花蛇舌草、半枝莲进行检索并整理获得活性化合物和作用靶点使用 语言将与药物活性成分相关的靶点和疾病靶点进行匹配映射且绘制韦恩图()将获得的潜在抗肺腺癌的作用靶点构建养正消积胶囊靶点蛋白相互作用网络进行 通路分析和基因本体()富集分析.养正消积胶囊提取物制备将养正消积配方粉添加至纯 溶液中并在 条件下静置 离心机 /离心 后过滤上清液用平衡盐溶液稀释提取物使用分光光度计在波长 波长下进行光密度定量化以透光度.的溶液作为标准实验用药将养正消积胶囊提取物命名为 用于后续实验.细胞培养及分组将(含有浓度为的胎牛血清、浓度为 双抗)培养基于培养箱(、)中对人肺腺癌 细胞进行培养观察每日的生长情况 依据不同浓度将细胞分为空白对照组、高()、中()、低()浓度组.法测定 对人肺腺癌 细胞增殖能力将 细胞(个细胞/孔)接种到 孔板中然后用不同浓度的(、)处理 将 溶液添加到 孔板中 温育 后采用酶标仪检测细胞吸光度值.细胞划痕实验 将浓度为 个/的 细胞接种至 孔板 细胞贴壁后 枪头垂直于培养板背面划痕 清洗 次将细胞随机分为 组:对照组、低、中、高浓度组给予对应浓度药液处理后继续培养分别于、时拍照观察 并绘制 时各组细胞迁移距离的柱状图 实验至少重复 次.侵袭实验将 用 培养基稀释后加入 上室 取不同浓度 干预 的对数生长期 细胞消化后放入不含胎牛血清的 培养液中 将细胞浓度调整为 个/的细胞接种至 上室混有血清和细胞的培养基缓慢加入下室 在 、小室内培养 后取出细棉签轻擦小室内部未穿膜的细胞固定 (固定物:多聚甲醛)染色 (染色物:结晶紫)显微镜下拍照计数.流式细胞术检测 细胞凋亡率将对数生长过程的 细胞按照每个孔 /个接种于 孔板内 在 的培养环境下培养 待细胞贴壁生长后向实验组中加入提前配好的不同浓度 溶液置于培养箱中培养 收集上述处理后的细胞用提前预冷的无菌 溶液洗涤后加入 缓冲液 随后加入 溶液和碘化丙啶溶液各 细胞放置周菁等 养正消积胶囊通过抑制/信号通路诱导肺腺癌细胞凋亡和自噬的作用研究在避光黑暗处轻轻震荡 后加 缓冲液 摇匀上机检测细胞凋亡率.检测 激活剂对各组细胞中、表达的影响在 孔板内接种将密度为 个/的 细胞贴壁生长融合 时将浓度相当的 干预细胞加入在培养箱(、)中培养 后收集细胞各组细胞总蛋白的提取使用蛋白提取试剂盒试剂盒检测蛋白浓度 下将混合均匀蛋白样品液与缓冲液变性 进行 分离蛋白、转膜、封闭加一抗(稀释的、抗体与 抗体)于 孵育过夜将二抗加至洗涤后的 室温避光孵育 洗膜、显影显影设备为化学发光显影试剂盒 为内参分析 对上述蛋白表达水平的影响 此后将细胞分为两组 一组加中浓度 干预一组加入 激活剂 干预置于培养箱(、)培养 后收集提取蛋白 法检测各组细胞中、蛋白的表达.统计学分析用 .统计软件进行数据处理与分析计量资料以()表示组间行独立样本 检验多组间比较行单因素方差()分析两两比较行 检验 和 .筛选得到这 种药物的潜在活性成分莪术 个黄芪 个白花舌蛇草 个半枝莲 个采用、和 数据库平台检索关键词“”共得到肺腺癌的潜在作用靶点 个靶基因中归属于黄芪的 个莪术 个白花舌蛇草 个半枝莲 个与肺腺癌基因取交集后共同靶点为 个 将黄芪莪术白花舌蛇草半枝莲与肺腺癌相关的关键靶点基因导入 软件进行网络构建及可视化得到养正消积胶囊治疗肺腺癌的有效活性成分 将黄芪莪术白花舌蛇草半枝莲治疗肺腺癌的潜在的关键靶基因导入 数据库平台获取各蛋白质之间的关系采用该平台绘制蛋白关系网络根据 的节点制作出前 个关键蛋白质节点分别为、后续的 富集分析结果显示养正消积胶囊与肺腺癌相关的关键生物学功能主要为细胞对化学应激的反应、对氧化应激的反应、对药物的反应、对凋亡信号通路的负向调节、对缺氧的反应、凋亡信号通路的负调控、凋亡信号通路的调控等 通路富集分析显示相关靶点主要富集的通路为脂质与动脉粥样硬化、信 号 通 路、信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、癌症中的蛋白糖、信号通路、信号通路等提示上述通路可作为研究养正消积胶囊抗肺腺癌疗效的重要方向 见图.法测定 对人肺腺癌 细胞增殖的影响与对照组相比低、中、高浓度 处理的 细胞增殖能力下降浓度越高细胞增殖能力越弱且不同浓度组间细胞增殖能力比较差异具有统计学意义(.)见图.对人肺腺癌 细胞迁移和侵袭能力的影响 处理后细胞迁移、侵袭能力较对照组弱且高浓度组 中浓度组 低浓度组 对照组(.)见图 及图.对人肺腺癌 细胞凋亡的影响与对照组相比 低、中及高浓度组中 细胞的凋亡率均增高(.)且浓度越高凋亡率越高 见图.对人肺腺癌 细胞自噬的影响 结果显示 细胞经 干预 后自噬标志蛋白 的表达水平升高同时促进 向 转化且 蛋白水平也升高(.)见图.对/信号通路相关蛋白表达水平的影响与对照组相比经 干预对数生长期的 细胞 后 能降低、和 蛋白的水平(.)而 对、蛋白的表达无影响 见图.激活剂 对/信号通路及自噬相关蛋白表达水平的影响与对照组相比加入 /浓度的 第 卷 第 期 年 月 川北医学院学报(:/).(激活剂)培养 后、表达均增多、表达减少、比值均降低(.)见图 AEDCB图1生物信息学分析获得养正消积胶囊治疗肺腺癌的活性成分及作用靶点A.肺腺癌靶基因与养正消积胶囊有效成分治疗靶点匹配基因；B.黄芪鄄莪术鄄白花舌蛇草鄄半枝莲药物、活性成分与肺腺癌关键作用靶点网络；C.养正消积胶囊治疗肺腺癌的蛋白质相互作用网络图；D.养正消积胶囊活性成分抑制肺腺癌的关键靶点基因本体生物学过程富集分析；E.养正消积胶囊活性成分抑制肺腺癌的关键靶点KEGG通路分析。高浓度组中浓度组低浓度组对照组*#*#*1.00.80.60.40.20.0吸光度值（OD450 mm)图2不同浓度DME25对肺腺癌A549细胞增殖能力的影响*P0.05，与对照组相比；#P0.05，与低浓度组相比；P0.05与中浓度组相比。2.01.51.00.50*#*#*高浓度组中浓度组低浓度组对照组迁移距离（mm）高浓度组中浓度组低浓度组对照组0 h12 h24 h图3DME25对人肺腺癌A549细胞迁移的影响*P0.05，与对照组相比；#P0.05，与低浓度组相比；P0.05与中浓度组相比。图4DME25对人肺腺癌A549细胞侵袭能力的影响A.对照组；B.低浓度组；C.中浓度组；D.高浓度组。ABCDFITC鄄A106105104103102PE鄄A%103104105106107FITC鄄A106105104103102PE鄄A%103104105106107FITC鄄A106105104103102PE鄄A%103104105106107FITC鄄A106105104103102PE鄄A%10310410510610718.33%62.67%18.28%0.72%13.52%13.68%72.42%0.38%8.18%81.12%0.42%3.31%0.38%96.12%0.19%P1高浓度组中浓度组低浓度组对照组6040200*#*#*高浓度组中浓度组低浓度组对照组调亡率（%）图5DME25对人肺腺癌A549细胞凋亡率的影响*P0.05，与对照组相比；#P0.05，与低浓度组相比；P0.05，与中浓度组相比。周菁等 养正消积胶囊通过抑制/信号通路诱导肺腺癌细胞凋亡和自噬的作用研究1.20.90.60.30.0*#*#*高浓度组中浓度组低浓度组对照组Beclin鄄1/鄄actin0.80.60.40.20.0*#*#*高浓度组中浓度组低浓度组对照组LC3鄄/鄄actin16 kD14 kD42 kD60 kD高浓度组中浓度组低浓度组对照组鄄actinBeclin鄄1LC3鄄LC3鄄图6DME25对人肺腺癌A549细胞自噬相关蛋白表达水平的影响*P0.05，与对照组相比；#P0.05，与低浓度组相比；P0.05，与中浓度组相比。p鄄PI3KPI3Kp鄄mTORmTorp鄄AKTAKT1.51.00.50.0*#*高浓度组低浓度组对照组*#*#*相关蛋白表达对照组高浓度组中浓度组低浓度组42 kD60 kD60 kD289 kD289 kD85 kD85 kD鄄actinAKTp鄄AKTmTORp鄄mTORP13Kp鄄P13K图7DME25对人肺腺癌A549细胞P13K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达水平的影响*P0.05，与对照组相比；#P0.05，与低浓度组相比。p鄄PI3KPI3Kp鄄AKTAKTp鄄mTORmTORBeclin鄄1LC3LC3*740Y鄄P(+)740Y鄄P(-)1.51.00.50相关蛋白表达+-740Y鄄PDME25鄄actinLC3鄄LC3鄄Bcclin鄄1鄄actin740Y鄄P+-mTORp鄄mTORAKTp鄄AKTPI3Kp鄄PI3K图8PI3K激活剂740Y鄄P对相关蛋白表达的影响*P0.05，与740Y鄄P（-）相比。讨论养正消积胶囊是一种由黄芪、莪术、白花舌蛇草、半枝莲等 味中药材共同组成的中药补益剂具有扶正祛邪、解毒化瘀及健脾益肾等功效对多种恶性肿瘤均具有良好的治疗效果 养正消积胶囊的药理作用机制研究显示该药可通过作用于、/、及其受体 等来起到抑制肿瘤进展的作用 一项纳入 项研究的 分析报告显示与单纯化疗相比养正消积 第 卷 第 期 年 月 川北医学院学报(:/).胶囊与化疗联合治疗非小细胞肺癌效果更优且可减轻化疗毒副反应 陈晓萌等研究也证实了养正消积胶囊对原发性肝癌具有明确的治疗效果且安全性较高 研究发现当细胞的凋亡受到抑制时便会导致肿瘤的发生和进展 本研究发现养正消积胶囊中四种中药黄芪、莪术、白花舌蛇草、半枝莲与肺腺癌密切相关的有效化合物槲皮素、谷甾醇、木犀草素、汉黄芩素等通过、等基因影响细胞对化学应激的反应、对氧化应激的反应、对药物的反应、对凋亡信号通路的负向调节可能是通过流体剪切应力、脂质与动脉粥样硬化、及 信号通路、癌症中的蛋白糖、及 等信号通路发挥作用 进而制备养正消积胶囊的提取物加入肺腺癌 细胞后通过表型实验发现与对照组相比 可降低 细胞的增殖及迁移侵袭能力提高细胞凋亡率提示 对肺腺癌具有明确的治疗效果细胞自噬指的是通过基因调控细胞自行结束生命的行为与细胞稳态、发育及免疫反应等多个生物学过程相关是目前新发现的癌症治疗靶点 为细胞自噬活性的标志性蛋白其亚型有 和 在自噬发生时可转化为 故可通过/值的高低来评估细胞的自噬水平 现已证实自噬相关基因 主要诱导自噬的启动是调节细胞正向自噬的最重要因子 研究显示 细胞经 干预 后自噬标志蛋白 的表达水平升高同时促进 向 转化即/升高且 蛋白水平也升高提示养正消积胶囊可对肿瘤细胞的自噬过程也有着一定的促进作用/信号通路是对肿瘤细胞增殖、凋亡等生物学行为均有一定调节作用的信号通路王军等研究亦证实抑制/信号通路可促进人结肠癌 细胞的凋亡和自噬本研究显示经 干预的各组 细胞中的、及 蛋白含量均低于对照组、/的比值亦低于对照组且呈剂量依赖性提示 可能是通过下调 细胞中、磷酸化水平促进细胞自噬进而抑制/信号通路的促癌作用综上养正消积胶囊养通过下调肺腺癌 细胞中、磷酸化水平促进细胞自噬抑制/信号通路的促癌作用参考文献 .:.():.杨硕陈正贤.晚期肺腺癌患者分子靶向治疗的研究进展.今日药学():.:.:.:.():.周琴张红陈孟溪.从中医气理论论治恶性肿瘤.中医药临床杂志():.凌智君.养正消积胶囊辅助手术治疗中晚期原发性肝癌的效果.河南医学研究():./.():./.():.李扬贾漪涛.养正消积方剂治疗恶性肿瘤作用机制的研究进展.疑难病杂志():.李强唐瑞吴勇俊等.养正消积胶囊联合吉非替尼治疗晚期肺腺癌临床研究.中医药临床杂志():.孙悦.养正消积胶囊的化学成分及药代动力学研究.天津:天津医科大学.肖祖林任真叶思思等.养正消积胶囊联合化疗治疗非小细胞肺癌的疗效及安全性的 分析.中药新药与临床药理():.陈晓萌范田.养正消积胶囊辅助放疗治疗晚期胃癌患者的近期疗效及作用机制.医药论坛杂志():./.(/):.:.:.:.王军杨雅娟刘海涛等.紫草素抑制/信号通路诱导人结肠癌 细胞凋亡和自噬的作用研究.药物评价研究():.(收稿日期:修回日期:)本刊网址:/作者投稿系统:/邮箱:.