中枢神经系统药物设计性实验.doc

中枢神经抑制药的急性毒性研究
【摘要】目的：从未知药物筛选出具有中枢神经抑制作用的目标药物，通过给小鼠腹腔注射，观察药物对中枢神经的抑制作用，并测定其LD50，以评价该药物的安全性。方法：预实验：将小鼠随机分成三组，通过腹腔注射母液，筛选出具有中枢抑制作用的目标药物，再将15只小鼠随机分成5组，确定LD0和LD100。正式实验：将45只小鼠随机分成5组，按计算好的剂量，对小鼠进行腹腔注射，观察小鼠的死亡情况，以测定LD50。结果：4号药为中枢抑制药，预实验中我们组确定抑制药的最大剂量为5mg/ml，最小剂量为2.5mg/ml，根据正式实验得到得数据经计算 LD50为3.82mg/ml。结论：受试药物的LD50为3.82mg/ml
【关键词】药物毒性；LD50 ；中枢抑制药
中枢神经系统药物是近年来销售额增长较快的药物类别， 2006 年全球市场规模达到 591 亿美元，年均增长率 9.46%，主要包括三个用药市场：抗抑郁和抗焦虑药、抗精神病药、抗癫痫药物。2005、2006 年我国中枢神经药物市场容量约为 71.96 亿元和 82.07 亿元。[2]本课题研究未知中枢抑制药物的急性毒性反应，测定LD50，分析其安全性。
1材料与方法
1.1实验动物
动物名称：小鼠
体重范围：18～22g
动物来源：广东药学院实验动物中心提供
1.2 药品
药品：中枢神经系统药物（包括兴奋药和抑制药）、生理盐水
来源：广东药学院药科学院药理系提供
1.3 实验步骤
1.3.1 预实验
确定正式实验做的药物，探索该抑制药物的0%和100%有效动物反应的剂量范围，以便正式实验时确定各组剂量。
实验过程：
1、确定主题，准备好实验方案。实验课上汇报本组预实验方案，并和其他 小组讨论实验的可行性以及需要注意的问题
2、开始实验，有三组不同编号的试样药物（分别为4号、5号、6号），通过现象自己做判定得结果。取小鼠18只，称其体重，标记并且记录各自的重量；
3、从18只老鼠中随机选取3只小鼠，用于母液的筛选，以0.1ml/10g的剂量，分别注射三组试样药物，观察现象并做好记录，判定哪个编号是何种药物，从中选择我们组的目标药物中枢抑制药；
4、剩下的15小鼠，分为5组，每组3只小鼠，进行抑制药物的研究。母液为20mg/ml，等比进行稀释，通过二分法确定药物稀释后的浓度。根据小鼠体重以0.2ml/10g的剂量腹腔注射药物的不同浓度，在30分钟内观察各组小鼠的反应，并记录死亡小鼠的数量
5、 通过实验现象观察，得出结果，找到了我们组抑制药能引起小鼠的0%和100％有效率剂量及其所在的范围。
1.3.2 正式实验
按预计实验的实施方法进行，完成所选兴奋药物的LD50的测定。
实验剂量的计算r=(Dmin/Dmax)^(1/(n-1))
根据预实验结果：Dmax=5 mg/ml及Dmin=2.50 mg∕ml，设正式实验的剂量组数n=5，剂量公比r=0.8409，则各组剂量为：
1)5 mg∕ml
2) 5*0.8409=4.20mg∕ml
3) 4.20mg∕ml*0.8409=3.54mg∕ml
4) 3.54mg∕ml*0.8409=2.97 mg∕ml
5) 2.97mg∕ml*0.8409=2.50 mg∕ml
 实验过程：
 1、取小鼠45只，称重，标记，随机分为5组，使不同性别和体重能均匀分配于各组，每组9只，进行下一步实验；
2、各组动物分别腹腔注射相应浓度（上述已算好的剂量）的药液0.2ml/10g，立即仔细观察，记录动物反应情况、死亡时间和数目。
3、根据实验验所得数据，计算LD50
1.3.2 实验汇报、点评、总结
1.4 数据处理方法
实验结果以小鼠是否死亡为指标，以注射浓度的对数为横坐标，以几率单位为纵坐标，通过EXCEL作图求得回归方程，从而计算出LD50。
2 结果
表1 预实验筛选药物情况
组别 编号 现象 药物
1 5 小鼠变得很暴躁，上下跳动，异常活泼，呼吸加快，最后死亡 兴奋药

2 4 小鼠变得安静嗜睡，呼吸微弱，3min后死亡 抑制药

3 6 没出现任何异常现象 生理盐水

表2 预实验的实验结果
组别 剂量（mg∕ml） 现象 死亡率（﹪）
1
10
5
2.5
4
3
三只小鼠全部死亡,死亡时间约4min
三只小鼠全部死亡,死亡时间约10min
三只小鼠全部存活，嗜睡
一只死亡，两只嗜睡，有呼吸
一只死亡，两只嗜睡，有呼吸

100
100
0
66.7
66.7
2
3
4
5

表3 正式实验的实验结果
组别
剂量（mg∕ml）
现象

死亡小老鼠数
1
2

3

4

5

5
4.20

3.54

2.97

2.50
9只小老鼠全部死亡
6只小老鼠死亡，3只存活，嗜睡
四肢无力，翻正反射消失，呼吸抑制
1只小老鼠死亡，8只存活，嗜睡
四肢无力，翻正反射消失，呼吸抑制
1只小老鼠死亡，8只存活，嗜睡
四肢无力，翻正反射消失，呼吸抑制
全部存活，嗜睡，四肢无力
翻正反射消失，呼吸抑制

9
6

1

1

0

表4 中枢神经抑制药LD50的测定
组别
剂量（mg//ml）
总动物
死亡动物数
死亡率（%）
剂量对数
几率单位
1
5

9
9

100.0

0.699
7.33
2
4.2

9
6

66.7

0.623
5.44
3
3.54

9
1

11.1

0.549
3.77
4
2.97

9
1

11.1

0.473
3.77
5
2.5

9
0

0

0.398

图1 LD50的测定结果
回归方程为：y=16.385x-4.5243
LD50=10^[(5+4.5243)/16.358]=3.82（mg/ml）
3 讨论
1、本实验是作用于中枢神经系统药物的设计性实验。在这次实验中，锻炼了我的综合实验技能，很大程度上提高了我们的动手能力和思考能力，培养了我们团队协作的精神，并且学会了LD50的测定方法。
2、作用于中枢神经系统的药物主要影响递质和受体而发挥作用，其药理效应主要表现是中枢神经系统功能的增强或抑制。其抑制作用一般变现为镇静、催眠、抑郁甚至死亡。[1]
3、预实验时，观察三组试样药物注射完后小鼠的表现，第一只小鼠变得很暴躁，上下跳动，异常活泼，呼吸加快，最后死亡。第二只小鼠变得安静嗜睡，呼吸微弱，约3min后死亡。第三只小鼠没出现任何异常现象。由此推断三种药物分别是兴奋药，抑制药，生理盐水。
4、本次实验结果并不理想，几率单位对浓度对数做回归曲线图，线性相关较差，即预测药物的给药量与动物死亡率间不能呈现正态分布。 
5、实验误差的来源可能是：
（1）注射器的刻度不标准，或者里面含有少量气泡，导致每次并非严格按规定剂量给药,用移液管稀释浓度时操作不够规范存在较大误差。
（2）腹腔注射给药时，推注速度不均一，推注过快有可能影响小鼠的死亡情况。
（3）实验中，给药，配制药液时，均由不同组员进行配制，进而可能出现主观性误差。
（4）小鼠个体存在较大差异，并且数量有限。
（5）本次设置小鼠的观察时间为30分钟，观察这段时间内小鼠死亡的情况，可能会由于观察时间不足导致实验产生误差。
（6）实验结果处理不够科学，如没有求出LD50的可信区间，也没有进行t-检验等。
4 结论
1、 根据小鼠的药后反应，可判断5号药物为中枢神经兴奋药，4号药物为中枢 神经抑制药，6号药物为生理盐水，故选择4号药物为目标药物进行后续实验研究。
2、预实验：LD0为2.5mg/ml为,LD100为5mg/ml
3、正式实验：LD50 =3.82mg/ml
参考文献：
［1］ 谭毓治.药理学实验指导[M]（第二版）.广东高等教育出版社.2012:104-108
[2] 李淑花 ,徐军. 恩华药业中枢神经药物的专科药企[J].证券时报,2008-07-21,第 C04版