丙酮酸发酵实验.doc

丙酮酸发酵实验
1.实验目的
学习掌握利用发酵法生产丙酮酸的原理，掌握丙酮酸、残糖和菌体浓度的测定方法和工艺操作。
2.实验原理
丙酮酸是机体代谢的中间产物，既处于糖酵解（EMP）途径的末端，又是连接EMP途径和TCA循环的关键产物，它可经多条途径生成乙醇、乳酸、草酰乙酸、丙氨酸、缬氨酸和异亮氨酸等。因此其所处的位置极为特殊。根据代谢控制育种和发酵原理，要想在生物体内大量积累丙酮酸，就必须进一步切断或更确切地说是减弱丙酮酸的进一步代谢支路，加速丙酮酸的合成速度，去除代谢产物的反馈阻遏或反馈抑制（图1）。

葡萄糖

甘油
NA

异亮氨酸，缬氨酸
磷酸烯醇式丙酮酸

B1
B1
ADH
NA
PDC
乙醇

NA
乙醛
乳酸
丙酮酸

NA
LDH
AIDH
PDC

乙酸
NA

B1

Pdx
ACS
乙酰辅酶A

丙氨酸
草酰乙酸

Pdx

谷氨酰胺

α-酮戊二酸

谷氨酸

加速代谢流
切断或减弱

圈内为辅酶或辅基（NA表示烟酸，B1为硫胺素，Bio为生物素，Pdx为吡哆醇。

图1 丙酮酸的代谢途径及发酵机制

3 实验仪器与材料
5L自动控制发酵罐 TGL-16G台式高速离心机 　752型紫外可见分光光度计　500mL三角瓶 HZQ-Q恒温振荡器 手提式压力蒸汽灭菌器 LRH-250A型生化培养箱 SBA-40C型生物分析传感仪
实验菌种：烟酸、硫氨酸、生物素和吡哆醇缺陷型的光滑球拟酵母（Torulopsis glabrata）
种子培养基(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨10，KH2PO4 1，MgSO4·7H2O 0.5，pH 5.6，自来水1L。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖 80g/L，蛋白胨 3g/L，硫酸铵5.9g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，烟酸8mg/L，盐酸硫胺素20µg/L，生物素10µg/L，盐酸吡哆醇 0.5mg/L，金属离子母液5mL/L，pH 5.6。
金属离子母液：CaCL2·2 H2O，2g，FeSO4·7H2O，2g；ZnCL2，5g，MnCL·4H2O，0.2g，CuSO4·5H2O，0.5g，2mol/L HCL溶解后定溶至1L。

4 实验步骤与方法
（1） 种子培养
取新鲜斜面菌种1环，接入50 mL种子培养基（500mL锥形瓶）中，30℃，200r/min振荡培养20小时。
（2） 5L罐分批发酵实验
①空消：空罐灭菌。
②实消：将发酵培养基2.7L从进样口倒入5L发酵罐中，盖上盖子。检查发酵罐安装完好后，盖上灭菌罩，105℃灭菌15分钟。
③校正：校正pH电极、溶氧电极（校正方法参考5L罐使用说明书）
④接种与发酵：在接种圈的火焰保护下，将种子培养液300mL倒入发酵罐中，控制发酵温度30℃，pH为6.0, 溶氧:0-12h通风60L/h，发酵罐搅拌 100r/min，12-72h停止通风和搅拌。自动流加8mol/L NaOH溶液控制发酵液pH为5.0±0.05，发酵过程产生的泡沫较多时，手动加入已灭菌的泡敌2-3滴即可迅速消泡，当残糖浓度低于5g/L时发酵结束。
⑤测量：每隔4h取样，测菌体浓度、葡萄糖和丙酮酸浓度。
在火焰下，按10%(v/v)接种量将种子接入发酵罐中，装液量3L，通风量1 L/(L·min)，发酵温度30℃，通过调节搅拌转速控制溶氧(DO)：1-12h控制溶氧值为80~100%，12~ 控制溶氧值为70-80%。自动流加8mol/L NaOH溶液控制发酵液pH为5.0±0.05，发酵过程产生的泡沫较多时，手动加入已灭菌的泡敌2-3滴即可迅速消泡，当残糖浓度低于5g/L时发酵结束。
（3）分析方法
①菌体干重的测定
将含有4mL发酵液的塑料离心管置于台式离心机中，于10000 r/min下离心5min,放于电热鼓风干燥箱80℃ 烘干至衡重，计算出细胞干重。上清液用于测定残糖浓度、丙酮酸浓度。
② 葡萄糖的测定
用SBA-40C型生物传感仪检测。将离心后的上清夜稀释适当的倍数(100倍)，用进样器吸取25μL进样。

③ 丙酮酸的测定
取10mL丙酮酸发酵液，离心（4000r/min,10mL）除去菌体，取5mL离心后的上清液至于500mL容量瓶中，再加入5mL 0.01mol/L的硫酸溶液进行酸解，使有机酸游离出来，然后定容并取适量以0.45μm孔径的滤膜过滤即得到待测样液。
采用反相色谱柱ODS-2 HYPERSIL(250mm×4.6mm，5μm)，以0.05mol/L NH4H2PO4 （用H3PO4调pH2.6）作为流动相，在流速1mL/min，波长215nm下测定。
5实验数据处理
发酵培养时，按照一定的时间间隔取样测定并记录，结果如下表。
时间
／h
葡萄糖浓度
/(g/L)
菌体干重
/(g/L)
丙酮酸浓度
/(g/L)
0

4

8

12

16

20

24

28

32

36

40

44

48

6 结果与讨论
（1）按照上表给出的相应数据，以时间为横坐标，表中数据为纵坐标绘图，分析各量的变化规律。
（2）糖酸转化率(%)：生成丙酮酸的克数与消耗葡萄糖克数之比的百分数。

7. 参考文献
（1）高年发 张现青 《溶氧对发酵丙酮酸的影响》[J]天津. 天津科技大学学报vol9.No.3. 2004.
（2）楼良旺 高年发《 紫外分光光度法测定丙酮酸》[J]北京：分析实验室.vol24.No.4.2005.
（3）高年发 吴迪 张健 《反相高压液相色谱法测定丙酮酸发酵液中丙酮酸》[J]天津.天津科技大学学报。Vo21.No.1. 2006.
（4）占桂荣 高年发《不利用丙酮酸的丙酮酸生产菌的选育》[J]生物加工过程.Vo4.No.4. 2006.
8. 预习与思考
请预习《 紫外分光光度法测定丙酮酸》、《反相高压液相色谱法测定丙酮酸发酵液中丙酮酸》、《不利用丙酮酸的丙酮酸生产菌的选育》并思考：
（1）光滑球拟酵母发酵产生丙酮酸的机制是什么？发酵培养基配制的要点有哪些？
（2）光滑球拟酵母丙酮酸发酵的条件控制要点是什么？