杏叶防风的化学成分及抗炎活性研究_李丽.pdf

，（）：李丽，雷艳，汪洋，等，杏叶防风的化学成分及抗炎活性研究 广西植物，（）：，（）：杏叶防风的化学成分及抗炎活性研究李 丽，雷 艳，汪 洋，马 雪，陆 苑，刘春花，王永林，（贵州医科大学 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心 省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵阳；贵州医科大学 贵州省药物制剂重点实验室，贵阳；贵州医科大学 药学院，贵阳 ）摘 要：杏叶防风（）为贵州苗族习用草药，用于黄疸型肝炎、急性胆囊炎等病症的治疗。为探究杏叶防风的化学成分及其抗炎活性，该研究采用硅胶、凝胶、等色谱技术对杏叶防风全草乙醇提取物进行分离纯化，通过、等波谱数据鉴定化合物结构，采用脂多糖（）诱导的 巨噬细胞作为炎症模型，评价单体化合物的抗炎活性。结果表明：（）从杏叶防风中分离并鉴定了 个化合物，分别为香草醛（）、芝麻素（）、甲基羟基甲氧基苯并 氢化呋喃酮（）、原儿茶醛（）、，（）、异鼠李素（）、山奈酚（）、羟基甲基色原酮（）、木犀草素（）、槲皮素（）、葡萄糖（，）（）羟基棕榈酰胺十八烯，三醇（）、异鼠李素半乳糖苷（）、异槲皮苷（）、去甲当药醇苷（）、木犀草素阿拉伯糖苷（）、山奈酚半乳糖苷（）、山奈酚葡萄糖苷（）、木犀草素葡萄糖苷（）、异牡荆苷（）、芦丁（）。其中，化合物、均为首次从该植物中分离得到。（）抗炎结果显示，化合物、均可显著抑制 诱导 细胞 释放量（，），其中化合物、在浓度为 时，抑制率分别为、。该研究丰富了杏叶防风的化学成分，明确了黄酮类化合物是其发挥抗炎功效的活性成分，为杏叶防风的进一步研究与开发利用提供了一定的依据。关键词：杏叶防风，化学成分，分离鉴定，细胞，抗炎活性中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，；，；，）收稿日期：基金项目：国家自然科学基金（）；贵州省高层次创新型人才培养计划（）。第一作者：李丽（），硕士研究生，主要从事药效物质基础与质量控制技术研究，（）。通信作者：王永林，博士生导师，教授，主要从事中药新技术、新工艺研究与新药研究开发，（）。：，（）（），：（）（），（），（）（），（），（），（），（），（），（），（），（，）（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（，），：，杏叶防风（）为伞形科（）茴芹属（）多年生草本植物，又名杏叶茴芹、山当归、骚羊古、蜘蛛香等，为贵州民间常用草药之一，收载于贵州省中药材、民族药材质量标准（版）中，广泛分布在我国广西及西南一带。其味辛、微苦、性温，归肝、肺、脾、胃经，以全草入药用于治疗上腹部疼痛、消化不良、痢疾和蛇咬伤等（危英等，；赵超等，），在许多地方药志中均有记载，如贵阳民间药草述其“温中散寒止痛，治中寒、发痧、胃痛、腹痛”，四川中药志记载其“消食健脾，截疟；用于中寒腹痛、寒疝偏坠、风湿痹痛、脾虚食滞和疟疾；近有用于治淋巴结结核”。近年来该药已被研制用于治疗慢性乙型肝炎、脂肪乳致静脉炎等复方制剂（曾德祥，；孙霞，）。目前，杏叶防风已分离鉴定的化学成分主要有黄酮类、甾醇类及挥发油类等（梁光义等，；常星，；邢煜君等，），有关杏叶防风化学成分文献报道较少，对其化学成分的活性研究更少，除已报道的 葡萄糖苷酶抑制活性、抗氧化活性及抗菌活性外（，），未见该植物其他药理作用的有关报道，其抗炎物质基础不明确。因此，为深入了解杏叶防风化学成分，探究其抗炎活性物质，本研究对杏叶防风全草 乙醇提取物进行分离纯化，分离并鉴定了 个化合物，并对其中的 个化合物进行了抗炎活性测定，以期为杏叶防风的深入研究和开发利用提供科学依据。仪器与材料 材料药材：杏叶防风药材采收于贵州花溪高坡，经贵州中医药大学药学院孙庆文教授鉴定为伞形科茴芹属植物杏叶防风（）的干燥全草。其凭证样品（）保存于贵州省药物制剂重点实验室。细胞株：小鼠单核巨噬细胞 购自 中心。仪器 核磁共振波谱仪（日本电子株式会社）；型超导核磁共振仪（德国 公司）；超高液相色谱三重四极杆串联质谱仪（美国 公司）；细 胞 培 养 箱（公 司）；期李丽等：杏叶防风的化学成分及抗炎活性研究 多功能酶标仪（美国 公司）；倒置显微镜（日本 公司）。试剂 型大孔树脂（天津市海光化工有限公司）；柱层析硅胶、薄层层析硅胶（青岛海洋化工有限公 司）；葡 聚 糖 凝 胶 （瑞 士 公司）；凝胶、凝胶（日本东曹株式会社）；（日本 公司）；试剂均为分析纯。胎牛 血 清、高 糖 培 养 基（美 国 公司）；脂多糖（）、青链霉素混合液、二甲基亚砜、缓冲液（北京 科技有限公司）；试剂盒（美国 公司）；试剂盒（南京建成生物工程研究所）；地塞米松（，上海甄准生物科技有限公司）。实验方法 提取与分离取干燥的杏叶防风全草（）切成粗段，用乙醇加热回流提取 次，合并提取液，减压回收溶剂得浸膏（），过 大孔吸附树脂，用水（倍柱体积）、乙醇（倍柱体积）依次洗脱，得水段浸膏（）、乙醇段浸膏（）。乙醇段经正相硅胶柱层析，以二氯甲烷甲醇（）进行等度洗脱，回收溶剂，浓缩后得干浸膏 ，经正相硅胶柱层析，以石油醚乙酸乙酯（）、乙酸乙酯甲醇（）进行梯度洗脱，分段收集，各段进行 检测合并后浓缩，得到 个组分（）。过 正 相 硅 胶 柱，以 石 油 醚 二 氯 甲 烷（）、二氯甲烷甲醇（）梯度洗脱，检测合并后浓缩，得到 个组分（）。其中，反复过 （二氯甲烷甲醇 ）、（甲醇），得化合物（）、化合物（）。反复过正相硅胶、（二氯甲烷甲醇 ）、（甲醇）、（甲醇），得化合物（）。过 （二 氯 甲 烷 甲 醇 ），检 测 合 并 后 浓 缩，得 到 个 组 分（）。其中，反复过 （甲醇）、（甲醇），得化合物（）、化 合 物 （）。过 （甲 醇）、（甲醇），得化合物（）。过（甲醇），得化合物（）。过 （甲醇），检测合并后浓缩，得到 个组分（）。其中，过 （甲 醇）、（甲醇）、（丙酮水）、柱色谱（甲醇水），得化合物（）。过 （甲醇）、（甲醇）、（甲醇），得化合物（）。过 （甲醇），得化合物（）。过正相硅胶，以二氯甲烷甲醇（）进行梯度洗脱，得到 个组分（）。过 （甲醇）、（甲醇）、（二氯甲烷甲醇 ）、柱色谱（甲醇水）、（甲醇）、（丙酮水），得化合物（）、化合物（）、化合物（）。过 （甲醇）、（甲 醇）、柱 色 谱（甲 醇 水）、（甲 醇）、（丙酮水），得化合物（）、化合物（）、化合物（）、化合物（）。过 （甲醇），得到 个组分（）。其中，过 （甲醇）、（甲醇）、（丙酮水）、正相硅胶柱、二氯甲烷甲醇（），得化合物（）、（）、化合物（）。抗炎活性评价取对数生长期的 细胞，调整细胞浓度为每毫升 个，每孔 接种于 孔板中，置于 、的培养箱中培养 。实验设置空白组、模型组、阳性对照组和给药组，每组设置 个复孔，阳性对照为地塞米松（）。空白组和模型组加入完全培养基，阳性对照组加入终浓度为 ，给药组加入安全浓度范围内的化合物。培养 后，除空白组外，其他组均加入终浓度为 的，培养 后收集上清液，按 检测试剂盒说明书测定上清液 水平，重复 次实验。按公式（）计算 含量，按公式（）计算 抑制率。广 西 植 物 卷 含 量（）（测定 空白）（标准空白）标准品浓度（）稀释倍数（倍）（）抑制率（）（含量 含量样品）（含量 空白）（）统计学分析采用 和 软件进行数据的分析处理，组间差异比较采用单因素方差分析（）进行比较，两组间比较采用 法，检验水准 为有统计学意义。结构鉴定化合物：白色针状结晶。：，分子式。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献（陈美安和甄丹丹，）基本一致，故鉴定该化合物为香草醛。化合物：白色针状结晶。分子式。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（），（，），（，），（，）。以上数据与文献（吴美婷等，）基本一致，故鉴定该化合物为芝麻素。化合物：白色粉末。：，分 子 式。（，）：（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献（石慧丽等，）基本一致，故鉴定该化合物为 甲基羟基甲氧基苯并 氢化呋喃酮。化合物：白色粉末。：，分 子 式。（，）：（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献（杨超等，）基本一致，故鉴定该化合物为原儿茶醛。化合物：黄色粉末。：，分 子 式。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献（，）基本一致，故鉴定该化合物为，。化合物：黄色粉末。：，分 子 式。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献（董丽华等，期李丽等：杏叶防风的化学成分及抗炎活性研究）基本一致，故鉴定该化合物为异鼠李素。化合物：黄色粉末。：，分 子 式。（，）：（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（，），（），（，），（），（），（）。以上数据与文献（，）基本一致，故鉴定该化合物为山奈酚。化合物：白色粉末。：，分 子 式。（，）：（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献（王洪玲等，）基本一致，故鉴定该化合物为 羟基甲基色原酮。化合物：黄色粉末。：，分 子 式。（，）：（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献（陈林等，）基本一致，故鉴定该化合物为木犀草素。化合物：黄色粉末。：，分 子 式。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献（王晓阳等，）基本一致，故鉴定该化合物为槲皮素。化合物：白色无定型粉末。：，分子式。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（均为），（）。以上数据与文献（黄朝辉等，）基本一致，故鉴定该化合物为 葡萄糖（，）（）羟基棕榈酰胺十八烯，三醇。化合物：黄色粉末。：，分 子 式。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，糖上的质子）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献（张涛等，）基本一致，故 鉴 定 该 化 合 物 为 异 鼠 李 素半 乳糖苷。化合物：黄色粉末。：，分 子 式。（，广 西 植 物 卷）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，糖上的质子）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献（余邦伟等，）基本一致，故鉴定该化合物为异槲皮苷。化合物：黄色粉末。：，分 子 式。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（糖上的质子）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以 上 数 据 与 文 献（，）基本一致，故鉴定该化合物为去甲当药醇苷。化合物：黄色粉末。：，分 子 式。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，糖上 的 质 子）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以 上 数 据 与 文 献（，；，）基本一致，故鉴定该化合物为木犀草素阿拉伯糖苷。化合物：黄色粉末。：，分 子 式。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（糖上的质子）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（，），（），（，），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献（石舒雅等，）基本一致，故鉴定该化合物为山奈酚半乳糖苷。化合物：黄色粉末。：，分子式。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，糖上的质子）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（，），（），（，），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献（李彦等，）基本一致，故鉴定该化合物为山奈酚葡萄糖苷。化合物：黄色粉末。：，分 子 式。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，糖上的质子）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），期李丽等：杏叶防风的化学成分及抗炎活性研究（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献（肖春荣等，）基本一致，故鉴定该化合物为木犀草素葡萄糖苷。化合物：黄色粉末。：，分 子 式。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，糖上的质子）；（，）：（），（），（），（），（），（），（，），（），（，），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献（任英杰等，）基本一致，故鉴定该化合物为异牡荆苷。化合物：黄色粉末。：，分 子 式。（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（糖上的质子）；（，）：（），（），（），（，），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）。以上数据与文献（，）基本一致，故鉴定该化合物为芦丁。抗炎活性筛选结果利用 法测定 细胞在不同化合物浓度环境下的存活率来评价对应化合物的细胞毒性作用。根据细胞毒性测试结果对本实验化合物的给药浓度进行设计，结果显示，化合物、在浓度为 时，化合物、在浓度为 ，化合物、在浓度为 时细胞存活率均在 以上，表明在此给药浓度范围内无细胞毒性。采用 造模 后，与空白组相比，模型组细胞的 分泌量显著增加（），表明造模成功。由表 可知，与模型组相比，除 个化合物（化合物、）对细胞的 分泌量无显著影响外，化合物、在浓度为 时，化合物、在浓度为 时，化合物、在浓度为 时均可显著降低细胞的 分泌量（，）。讨论与结论本研究从杏叶防风全草 乙醇提取物中分离鉴定了 个化合物，包括 个黄酮类化合物（、），个酚类化合物（、），个木脂素类化合物（），个苯丙烷类化合物（）和 个酰胺类化合物（）。其中，化合物、均为首次从茴芹属植物中分离得到，化合物、均为首次从杏叶防风中分离得到。炎症是机体稳态受到干扰时常见的病理状态，许多疾病的发生会伴随着炎症的产生，即“十病九炎”。炎症的发生是由多种炎症介质、细胞因子及信号通路共同参与调节来完成的，作为一种同时拥有促炎和抗炎双重作用的生物活性物质（曹谨玲等，；李潭等，），在炎症级联反应中，特别是在炎症反应的发生和信号传导方面起到关键的调节作用（羊波等，）。因此，本研究利用 诱导 细胞产生 为评价模型，从实验结果来看，木脂素类化合物（）、苯丙烷类化合物（）、黄酮类化合物（、）及酚类化合物（）在安全浓度范围内对 诱导 细胞产生的 具有显著抑制作用，其抑制率分别为、。其中，化合物 在 浓度下，化合物、在 浓度下的 抑制率与阳性对照药地塞米松在 浓度下的 抑制率相当。广 西 植 物 卷图 化合物 的结构式 目前，茴芹属民间药用植物的药理活性研究多为粗提物，单体化合物的药理活性尤其是抗炎活性方面的研究较少，仅见短果茴芹甲醇提取物中分离得到的奎宁酸衍生物对 诱导 细胞的抗炎活性（，）。本研究对杏叶防风进行了化学成分和抗炎活性研究，在一定程度上丰富了杏叶防风的化学成分，初步探明了黄酮类化合物是其发挥抗炎作用的活性成分，为进 期李丽等：杏叶防风的化学成分及抗炎活性研究表 杏叶防风化合物对 诱导 细胞产生 的抑制率（）（）化合物浓度（）抑制率（）化合物浓度（）抑制率（）一步研究和开发其药理活性奠定了基础，同时也为进一步扩大茴芹属药用植物的化学成分及活性研究提供了重要的参考依据。参考文献：，（）：曹 谨 玲，陈 剑 杰，李 丽 娟，等，艾叶挥发油对脂多糖诱导的巨噬细胞的抗炎作用 动物营养学报，（）：，：，常星，多枝柽柳和杏叶茴芹活性成分研究 郑州：河南大学，（）：，（），（）：陈林，王琦，吴蓓，等，百尾参化学成分的分离与鉴定（）中草药，（）：，（）：陈美安，甄丹丹，肺康明化学成分的研究 中成药，（）：，（）：董丽华，朱玉野，葛菲，等，叉分蓼黄酮类化学成分研究 中药材，（）：，：贵阳市卫生局，贵阳民间药草 贵阳：贵州人民出版社：，：贵州省药品监督管理局，贵州省中药材、民族药材质量标准 贵阳：贵州科技出版社：，（）：黄朝辉，徐康平，周应军，等，黄花倒水莲化学成分研究 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